مراكز استجواب جيرمنال أوتوريكتيفي الفردية بواسطة فوتواكتيفيشن في نموذج تشيميريك مختلط من المناعة الذاتية

هذا النموذج من الناحية الفسيولوجية chimeric ذات الصلة من مراكز الجرثومية التلقائية التلقائي يسمح ربط التعريب الخلوي في الجسم الحي مع التحليلات الجزيئية المصب. الميزة الرئيسية للنموذج المختلط من chimeric مراكز الجرثومية النشطة تلقائياً هي طبيعتها متعددة الاستخدامات والهامشية ، مما يسمح باستجواب أي مسار فرعي أو جزيئي خلوي مطلوب. إن الأهمية الفسيولوجية لهذا النموذج لتطوير أمراض المناعة الذاتية تمكن رؤى جديدة قد تساعد على تقدم العلاجات الجديدة.

يمكن استخدام هذا النموذج نخاع العظم الكيميرا في علم المناعة, المناعية الأورام, والبحوث الخلايا الجذعية. يحتوي مكون تنشيط الصور على استخدام واسع النطاق، حيث أنه يربط تعريب الأنسجة بتحليل الخلايا المصبية. إعداد نخاع العظم وإعادة تشكيل وفي الجسم الحي وضع العلامات والأنسجة خطوات جميعها معقدة من الناحية الفنية التي تصلح جيدا للمظاهرات البصرية.

لاستخراج المانح 564Igi عظم الفخذ والقدم، وإزالة الجلد من طرف واحد الخلفي، والخروج من مفاصل الركبة والكاحل عن طريق سحب على القدم بقوة. المضي قدما لكسر مفصل الكاحل. ثم، سحب القدم نحو الجسم في حين عقد على الساق، وبالتالي تجريد الأوتار والعضلات من الساق.

كسر مفصل الركبة للافراج عن الساق، وسحب العظام نحو الجسم مع التمسك بعظم الفخذ لتجريد الأوتار والعضلات من عظم الفخذ. ثم، إجراء شق في مفصل الورك، وقطع الأوتار قبل سحب عظم الفخذ من مقبس الورك. بعد إزالة عظام الأطراف الخلفية المقابلة بطريقة مماثلة ، فرك العظام بعناية بمنشفة ورقية خشنة لإزالة أي عضلة والأنسجة الضامة المتبقية ، وشطف العظام المجردة في عازل نخاع العظام الباردة الجليد.

ثم، استخدام دومون عدد سبعة ملقط لنقل العظام إلى حاوية من نخاع العظام العازلة الطازجة على الجليد. لاستخراج خلايا نخاع العظم، شطف هاون في الجليد الباردة نخاع العظام العازلة، واستخدام ماصة مصلية 10 ملليلتر لاستبدال العازلة غسل مع 10 ملليلتر من الطازجة، والجليد الباردة نخاع العظام العازلة. استخدام ملقط لنقل العظام إلى هاون، واستخدام الحشرات لسحق وطحن العظام لإطلاق نخاع العظام.

استخدم ماصة 10 ملليلتر لجمع مستخلص نخاع العظم قبل تمرير محلول نخاع العظم من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر على الجليد. ثم شطف هاون مع 10 ملليلتر إضافية من الطازجة، والجليد الباردة نخاع العظام العازلة لضمان الانتعاش الكامل للخلايا. لإعداد تعليق المانحين ، Mixs المناسب من وحدات GFP القابلة للتكف عن التصوير و 564Igi donor 564Igi نخاع في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ، و بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

Resuspend بيليه الخلية المختلطة بتركيز من مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثماني لكل ملليلتر من الجليد الباردة نخاع العظام العازلة، ونقل الخلايا إلى أنبوب مُكرَّس، 1.5 ملليلتر microcentuge على الجليد. بعد ذلك، تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع في ماوس المستلم CD45.1 المُعَدَّد، ونفض الغبار على أنبوب خلايا نخاع العظام المانحة لضمان إعادة الضم الكافية. تحميل 200 ميكرولترات من مزيج نخاع العظام في واحد 0.3 ملليلتر، حقنة الأنسولين 30 قياس، و، مع المتلقي على جانبها، وتمتد بلطف الجلد فوق وتحت العين لموسيقى البوب قليلا العين.

أدخل بعناية طرف الحقنة بزاوية 30 درجة تقريبًا في الجزء الأمامي من مقبس العين ، مع الحرص على تجنب العين والأنسجة المحيطة. عندما يلمس طرف الإبرة العظم الذي يُثبت مقبس العين، اسحب الإبرة حوالي 0.5 ملليمتر قبل استخدام الضغط الثابت لحقن نخاع العظام المتبرع ببطء. ثم، عودة الماوس إلى قفصه مع الإعلانية libitum المياه المضادات الحيوية، مع رصد حتى الشفاء الكامل.

لتسمية العقدة الليمفاوية الزهودي، تمييع اثنين من microliters من phycoerythrin المسمى الفئران المضادة للماوس CD169 المضادة في 18 ميكروليترس من برنامج تلفزيوني، وإضافة اثنين من قطرات 10 ميكرولتر من الجسم المضاد على قطعة من البلاستيك paraffin الفيلم. قم بتحميل كل قطرة في حقنة إنسولين واحدة سعة 0.3 ملليلتر بإبرة من عيار 30، وحقن 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة في لوحة القدم للحيوان المتلقي المُجرّد. قبل حصاد العقدة الليمفاوية، ضع غطاء مربع على سطح مستو، واستخدم حقنة التفريغ المحملة بالشحوم، خمسة ملليلتر لتتبع حواف الغطاء مع الشحوم حوالي 1 إلى 2 ملليمتر من كل حافة.

نقل الغرفة إلى سطح بارد، مستو، وملء فراغ غرفة الشحوم مع الجليد الباردة نخاع العظام العازلة. للوصول إلى الغدد الليمفاوية البورليتية، استخدم مقصًا مستقيمًا وهابطًا لإجراء شق في الجلد أسفل حفرة الركبة مباشرةً من المتلقي القتل الرحيم، وتمديد القطع إلى الأعلى على طول خط أوتار الركبة تقريبًا إلى مفصل الورك. باستخدام دومون عدد خمسة أو عدد سبعة ملقط، وسحب كل من اللوحات المكشوفة من الجلد إلى الخارج لفضح الأنسجة في فوسا popliteal، واستخدام ملقط لدخول بعناية فوسا فقط إلى الوريد البوبي.

فتح وإغلاق ملقط على طول محور الساق لفضح العقدة الليمفاوية البعبع الأساسية قبل استخدام الإبهام وإصبع السبابة لقرصة العضلات رباعية من الجانب الأمامي بروكسي إلى الركبة، لموسيقى البوب العقدة الليمفاوية من فوسا. حرك ملقط تحت العقدة الليمفاوية لتحرير العقدة من الأنسجة المحيطة بها، ووضعها في غرفة الشحوم فراغ. بعد أن تم جمع العقدة الليمفاوية الثانية، ضع غطاءً ثانية على حافة الشحوم الفراغية، واضغط لأسفل بلطف لإغلاق الغرفة، مع الحرص على قذف كل فقاعات الهواء.

لتحديد المراكز الجرثومية في عينات أنسجة الطحال المقطوعة، ضع غرفة التصوير على خشبة المجهر الفلوري الفلوري الفوتون، واستخدم ماصة نقل بلاستيكية 3.5 ملليلتر لوضع قطرة من الماء المقطر على قمة الغطاء العلوي. خفض الهدف حتى نقطة التماس، واستخدام الضوء المنقولة للتركيز على الجزء العلوي من الأنسجة. قم بالتبديل إلى الوضع المظلم والإثارة ذات الفوتونتين، وضبط الليزر إلى 940 نانومتر.

حدد موقع مناطق اللب الأبيض الفردية التي يحدها CD169 التي تلطخ بالقرب من سطح الأنسجة، وحدد الغمد اللمفاوي في ما حول آرتيستريولار بواسطة جيل التوافقيات الثاني المرتبط بالشريان المركزي. في المنطقة الواقعة بين الغَدَم اللمفاوي في ما حول الـورْطِيْرِقِي والمنطقةِ الهامشية، حددَ وجودَ ْمَلَقِةً عالية، مُفعَّلة بالجسم الجسمي، و، باستخدام هذه المعالم، رسم منطقة ذات فائدة حول منطقة مركز جرثومية واحدة. ثم، إعداد Z-كومة من حوالي 100 إلى 150 ميكرومتر في العمق، بدءا من سطح الأنسجة واستخدام حجم خطوة من حوالي ثلاثة ميكرومتر قبل التحول إلى الطول الموجي 830 نانومتر.

إيقاف أو تعتيم جميع القنوات لمنع photodamage للكشف عن، وصورة المكدس. ثم، قم بالتبديل مرة أخرى إلى الطول الموجي لإثارة 940 نانومتر، وإعادة فتح القنوات، والمسح الضوئي من خلال المكدس لتأكيد تنشيط فعال ضوئيًا وغيابًا للتجوال الضوئي في جميع أنحاء كومة الصور. يكشف serotyping من الكيميرا نخاع العظم مختلطة أرقام الخلية B تطبيع في ستة أسابيع بعد إعادة تشكيل, مع تردد منخفض من الخلايا B 9D11 إيجابية متداولة المستمدة من المقصورة 564Igi.

ضمن بوابة الخلايا الليمفاوية الإجمالية ، كان هناك تردد منخفض للخلايا المشتقة من المستلم المتبقية ، حوالي 6٪ منها مشتقة من CD45.1 ، مما يشير إلى درجة إجمالية من الوهم حوالي 94٪ كان هناك سخرية كاملة تقريبًا في حجرة الخلية B وهيمنة الخلايا B المشتقة من GFP القابلة للانشطة ، وهي نتيجة للاختيار السلبي الثقيل للخلايا B المشتقة من 564Igi. كما لوحظ، في وضع العلامات الحية مع CD169 يسهل التصور قوية للمنطقة الهامشية. إشارة التوافقيات الثانية واضحة في العناصر الهيكلية المحتوية على الكولاجين والأوعية الرئيسية، بما في ذلك الشريان المركزي للغلاف اللمفاوي ما حول النخاع والزمعروف الذاتي الشديد، الضامة اللسمة المنشطة المرتبطة بنشاط مركز الجراثيم.

تسمح هذه البيانات، مجتمعة، بتحديد منطقة ذات أهمية من المحتمل أن تحتوي على مركز رثائي واحد قابل للانكف. تقييم تدفق تدفق مزيد من تأكيد وجود أرقام المقصورة الخلية B تطبيع, السكان مركز الميلانينال عفوية, و مجموعة فرعية من الخلايا B مركز الجرثومية تنشيط photoactivated. من المهم تقييد إجمالي وقت التحول من خطوات الزرع، والتنمين الضوئي، وتجهيز الأنسجة إلى أربع إلى ست ساعات لضمان صلاحية كافية للخلايا.

يمكن أن تكون الخلايا المُكتَمَلة ضوئيًا مُصنَّفَة ومُرَضَّة لتسلسل الخلايا المفردة، على سبيل المثال، تُصفِّي ذخيرة مستقبلات الخلية ب لمركزٍ واحدٍ من الخلايا الجرثومية. وقد سمح نموذج الكيميرا المختلطة باستكشاف بيولوجيا مركز الجراثيم النشطة ذاتيًا على عمق جديد ، على سبيل المثال ، مما يوفر نظرة ثاقبة حول كيفية تطور عملية انتشار epitope. لاحظ أن مصدر الضوء للمجهر 2 فوتون هي قوية جدا نبض فئة 4 الليزر التي يمكن أن تلحق ضررا شديدا العينين.