تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

باستخدام هذه الطريقة يمكننا اختبار تكوين أنبوب القلب مباشرة ، وال حلقات ، وتشكيل غرفة كاملة دون مزيد من التلاعب التجريبية من جنين الماوس. على الرغم من أننا نستخدم MLC-2v-tdTomato الفئران كمثال على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة على نطاق واسع مع خطوط الماوس مراسل الفلورسنت الأخرى. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه بسيط جدا ولا يتطلب أي تقنيات معقدة أو معدات.

ويمكن أن يؤديها في إعداد مختبر العادية. بعد التزاوج الإناث مع الفئران الذكور، سواء MLC-2v-tdTomato 8 إلى 10 أسابيع من العمر، والتحقق من السدود لمقابس المهبل كل صباح. وضع السدود الحوامل, القتل الرحيم في أيام مختلفة بعد coitum, في موقف supine ورش البطن مع 70٪ الإيثانول.

استخدام مقص الجراحية الحادة والملقط لفتح تجويف البطن عن طريق شق من كل من الجلد وجدار البطن. بعد تحديد مواقع قرون الرحم الثنائية في الجزء الظهري من تجويف البطن ، قم بفصل الرحم بأكمله باستخدام مقص جراحي حاد وملقط لقطع بعناية فوق oviducts على كلا الجانبين. ضع الرحم الكامل المُشَرَّح في طبق بتري طوله 10 سنتيمترات مع PBS بارد.

باستخدام مقص جراحية حادة والملقط، وفصل بعناية كل كيس السلوي على طول قرن الرحم. استخدم ملاقط لنقل كل جنين إلى لوحة ثقافة 35 ملليمتر مليئة بـ PBS البارد. باستخدام مقص وجراحي حاد، وفتح كيس السلوي وفضح كل جنين عن طريق قطع الحبل السري ومن ثم تقليم الأنسجة الجنينية اضافية قدر الإمكان دون الإضرار الأجنة.

تحت مجهر تشريح مع الألياف البصرية المجهر الإضاءة، وقطع رأس الجنين ونقله إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مع 100 ميكرولترات من العازلة A لgenotyping في وقت لاحق لربط مع نتائج التصوير epifluorescent. باستخدام ملقط غرامة، وفتح صدر الجنين. مع مقص جراحي حاد وملقط، وإزالة القلب بعيدا عن الرئتين والأوعية الدموية.

استخدام ملاقط لنقل القلب الجنينية تشريح في لوحة ثقافة 35 ملليمتر مع برنامج تلفزيوني. ضع الطبق مع قلوب جنينية الماوس تحت مجهر تشريح الفرجورات. استخدام ملقط غرامة لوضع قلوب الجنينية بحيث البطينين النامية تواجه الفاحص.

اضبط التركيز باستخدام هدف 0.63x في وضع الحقل الساطع. التقط التعرض في المجال الساطع والتقاط صور متعددة. لتصور التعبير tdTomato، إيقاف الإضاءة المجهر الألياف البصرية وتعيين مرشح لفلوريسنس الأحمر.

إعادة التركيز على الصورة إذا لزم الأمر، وضبط السطوع والتباين، واتخاذ التعرض الفلورسنت الحمراء، والتقاط صور متعددة. بالنسبة للجنينات، قم بغلي عينات الرأس المعزولة سابقًا في المخزن المؤقت A عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين في 11، 360 مرات G.Transfer 20 ميكرولترات من عظمى إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر مع 20 ميكرولترات من العازلة B ومزيج.

استخدام 4.5 ميكرولترات من supernatant مختلطة كقالب الحمض النووي والجمع بين ذلك مع 0.5 ميكرولترات من كل من 10 micromolar محددة إلى الأمام وايبائة عكسها، 10 ميكرولترات من 2x premixed البوليمرات والعازل التفاعل ومن ثم إضافة الماء إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر. تشغيل PCR كما هو موضح في المخطوطة. تحميل التفاعل الانتهاء في 100 سلم الحمض النووي زوج قاعدة على هلام agarose 1٪وتشغيلها في 140 فولت في 1x TAE العازلة لمدة 25 دقيقة.

ضع الجل المكتمل على ترانيلوميناتوريناتور الأشعة فوق البنفسجية واشعل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتحديد نطاقات الحمض النووي. ويعتبر MLC-2V ليكون أقرب علامة لمواصفات غرفة البطين أثناء تطور القلب. في MLC-2v-tdTomato مراسل طرق في الفئران، والتعبير ضعيفة نسبيا من tdTomato في أنبوب القلب الخطي في E8.0 يصبح أقوى في E8.5 كما هو مبين باستخدام كامل جبل التصوير الظهارية من الأجنة.

باستخدام كامل جبل تصوير التحلل من القلب تشريح، يمكن بسهولة تحديد تشكيل غرفة البطين أثناء تطوير القلب الماوس. في القلب تشريح من جنين الماوس كله في E10.5، تم عرض التعبير مراسل MLC-2v-tdTomato في الجزء البطيني من القلب وليس في المسالك الداخلية، المسالك الخارجة، أو الأذين المستقبل. في E12.5 إلى E13.5، يتم التعبير عن مراسل tdTomato حصريا في البطينين من القلب أربع غرف.

وقد ظهر نمط التعبير الخاص بالبطين المماثل في جنين الفأرة المُشرَّح في E16.5. بعد التصوير كله، تم تحديد النمط الجيني للأجنة باستخدام مجموعتين من التمهيديات لـ PCR genotyping، مما يؤكد الأجنة المتجانسة التي تحمل الأليلية، غير المتروزيغو، والأجنة البرية. هذا الأسلوب هو جميلة بسيطة وبسيطة لتنفيذ.

الخطوة الحاسمة هي تشريح القلوب الجنينية. فهم تشريح القلب أثناء تطور القلب ضروري لعزل القلب بنجاح عن الجنين بأكمله.