تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي
April 17th, 2019
نقدم البروتوكولات لدراسة التنمية قلب الماوس باستخدام الفحص المجهري كله جبل ابيفلوريسسينت على الأجنة الماوس تشريح من البطين محددة حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران. هذا الأسلوب يسمح لنا بتصور كل مرحلة تشكيل البطين خلال الماوس قلب التنمية دون أساليب histochemical كثيفة العمالة مباشرة.
باستخدام هذه الطريقة يمكننا اختبار تكوين أنبوب القلب مباشرة ، وال حلقات ، وتشكيل غرفة كاملة دون مزيد من التلاعب التجريبية من جنين الماوس. على الرغم من أننا نستخدم MLC-2v-tdTomato الفئران كمثال على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة على نطاق واسع مع خطوط الماوس مراسل الفلورسنت الأخرى. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه بسيط جدا ولا يتطلب أي تقنيات معقدة أو معدات.
ويمكن أن يؤديها في إعداد مختبر العادية. بعد التزاوج الإناث مع الفئران الذكور، سواء MLC-2v-tdTomato 8 إلى 10 أسابيع من العمر، والتحقق من السدود لمقابس المهبل كل صباح. وضع السدود الحوامل, القتل الرحيم في أيام مختلفة بعد coitum, في موقف supine ورش البطن مع 70٪ الإيثانول.
استخدام مقص الجراحية الحادة والملقط لفتح تجويف البطن عن طريق شق من كل من الجلد وجدار البطن. بعد تحديد مواقع قرون الرحم الثنائية في الجزء الظهري من تجويف البطن ، قم بفصل الرحم بأكمله باستخدام مقص جراحي حاد وملقط لقطع بعناية فوق oviducts على كلا الجانبين. ضع الرحم الكامل المُشَرَّح في طبق بتري طوله 10 سنتيمترات مع PBS بارد.
باستخدام مقص جراحية حادة والملقط، وفصل بعناية كل كيس السلوي على طول قرن الرحم. استخدم ملاقط لنقل كل جنين إلى لوحة ثقافة 35 ملليمتر مليئة بـ PBS البارد. باستخدام مقص وجراحي حاد، وفتح كيس السلوي وفضح كل جنين عن طريق قطع الحبل السري ومن ثم تقليم الأنسجة الجنينية اضافية قدر الإمكان دون الإضرار الأجنة.
تحت مجهر تشريح مع الألياف البصرية المجهر الإضاءة، وقطع رأس الجنين ونقله إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مع 100 ميكرولترات من العازلة A لgenotyping في وقت لاحق لربط مع نتائج التصوير epifluorescent. باستخدام ملقط غرامة، وفتح صدر الجنين. مع مقص جراحي حاد وملقط، وإزالة القلب بعيدا عن الرئتين والأوعية الدموية.
استخدام ملاقط لنقل القلب الجنينية تشريح في لوحة ثقافة 35 ملليمتر مع برنامج تلفزيوني. ضع الطبق مع قلوب جنينية الماوس تحت مجهر تشريح الفرجورات. استخدام ملقط غرامة لوضع قلوب الجنينية بحيث البطينين النامية تواجه الفاحص.
اضبط التركيز باستخدام هدف 0.63x في وضع الحقل الساطع. التقط التعرض في المجال الساطع والتقاط صور متعددة. لتصور التعبير tdTomato، إيقاف الإضاءة المجهر الألياف البصرية وتعيين مرشح لفلوريسنس الأحمر.
إعادة التركيز على الصورة إذا لزم الأمر، وضبط السطوع والتباين، واتخاذ التعرض الفلورسنت الحمراء، والتقاط صور متعددة. بالنسبة للجنينات، قم بغلي عينات الرأس المعزولة سابقًا في المخزن المؤقت A عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين في 11، 360 مرات G.Transfer 20 ميكرولترات من عظمى إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر مع 20 ميكرولترات من العازلة B ومزيج.
استخدام 4.5 ميكرولترات من supernatant مختلطة كقالب الحمض النووي والجمع بين ذلك مع 0.5 ميكرولترات من كل من 10 micromolar محددة إلى الأمام وايبائة عكسها، 10 ميكرولترات من 2x premixed البوليمرات والعازل التفاعل ومن ثم إضافة الماء إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر. تشغيل PCR كما هو موضح في المخطوطة. تحميل التفاعل الانتهاء في 100 سلم الحمض النووي زوج قاعدة على هلام agarose 1٪وتشغيلها في 140 فولت في 1x TAE العازلة لمدة 25 دقيقة.
ضع الجل المكتمل على ترانيلوميناتوريناتور الأشعة فوق البنفسجية واشعل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتحديد نطاقات الحمض النووي. ويعتبر MLC-2V ليكون أقرب علامة لمواصفات غرفة البطين أثناء تطور القلب. في MLC-2v-tdTomato مراسل طرق في الفئران، والتعبير ضعيفة نسبيا من tdTomato في أنبوب القلب الخطي في E8.0 يصبح أقوى في E8.5 كما هو مبين باستخدام كامل جبل التصوير الظهارية من الأجنة.
باستخدام كامل جبل تصوير التحلل من القلب تشريح، يمكن بسهولة تحديد تشكيل غرفة البطين أثناء تطوير القلب الماوس. في القلب تشريح من جنين الماوس كله في E10.5، تم عرض التعبير مراسل MLC-2v-tdTomato في الجزء البطيني من القلب وليس في المسالك الداخلية، المسالك الخارجة، أو الأذين المستقبل. في E12.5 إلى E13.5، يتم التعبير عن مراسل tdTomato حصريا في البطينين من القلب أربع غرف.
وقد ظهر نمط التعبير الخاص بالبطين المماثل في جنين الفأرة المُشرَّح في E16.5. بعد التصوير كله، تم تحديد النمط الجيني للأجنة باستخدام مجموعتين من التمهيديات لـ PCR genotyping، مما يؤكد الأجنة المتجانسة التي تحمل الأليلية، غير المتروزيغو، والأجنة البرية. هذا الأسلوب هو جميلة بسيطة وبسيطة لتنفيذ.
الخطوة الحاسمة هي تشريح القلوب الجنينية. فهم تشريح القلب أثناء تطور القلب ضروري لعزل القلب بنجاح عن الجنين بأكمله.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولات لفحص تطور قلب الفأر باستخدام الميكروسكوب المناعي المضيء الكامل على الفئران المعدلة وراثيًا التي تنقل تقرير MLC-2v-tdTomato. تتيح هذه الطريقة التصور المباشر لمراحل تكوين البطين دون استخدام تقنيات نسيجية كيميائية معقدة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التنموي
- البحث في مجال القلب والأوعية الدموية
الخلفية
- يعتبر تطور القلب مجالًا مهمًا للدراسة في علم الأحياء التنموي.
- يمكن أن تكون الطرق التقليدية لدراسة مورفولوجيا القلب كثيفة العمالة.
- توفر الفئران المضيئة تقريرًا جديدًا لتصور هياكل القلب.
- تعتبر فئران MLC-2v-tdTomato نموذجًا مفيدًا لهذه الدراسات.
هدف الدراسة
- توفير طريقة بسيطة لتصور مراحل تطور القلب.
- لإظهار فائدة الفئران المضيئة في الدراسات التنموية.
- لتسهيل البحث دون الحاجة إلى تقنيات معقدة.
الطرق المستخدمة
- الميكروسكوب المناعي المضيء الكامل.
- استخدام الفئران المعدلة وراثيًا التي تنقل تقرير MLC-2v-tdTomato.
- تشريح الأجنة في مراحل مختلفة من التطور.
- إعداد تجريبي بسيط مناسب لبيئات المختبر العادية.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لتكوين أنبوب القلب ودورانه.
- ملاحظة واضحة لتكوين الغرف الكاملة.
- الطريقة قابلة للتطبيق على خطوط الفئران المضيئة الأخرى.
- بروتوكول أظهر سهولة الاستخدام في بيئة المختبر القياسية.
الاستنتاجات
- تبسط الطريقة المقدمة دراسة تطور القلب.
- تتيح للباحثين تصور المراحل الحرجة دون إجراءات معقدة.
- يمكن أن يعزز هذا النهج فهم التشكل القلبي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of ventricular chamber formation in mouse embryos using fluorescent reporter lines, supporting early-stage target validation in cardiovascular drug discovery. By simplifying heart morphology assessment without complex histochemistry, it enhances mechanistic de-risking of developmental pathways. The approach provides predictive confidence for evaluating compound effects on cardiac morphogenesis in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular specification mechanisms using MLC-2v as an early marker for chamber development.
- Operational Value: Supports functional target validation by directly linking genetic reporters to structural heart formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline ventricular morphology.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible whole-mount epifluorescent imaging across developmental stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for studying conserved cardiac morphogenesis pathways across vertebrates.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment by correlating tdTomato expression with ventricular chamber maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling direct assessment of cardiac structural phenotypes following genetic or pharmacological perturbation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting heart tube looping and chamber septation.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts to compare ventricular formation across experimental conditions.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based measurements of tdTomato expression to evaluate ventricular specificity.
- Translational Research: Connects early ventricular patterning to preclinical continuity through conserved developmental mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple fluorescent reporter lines beyond MLC-2v-tdTomato.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in ventricular chamber formation assessment.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized dissection and imaging protocols in regular lab settings.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on cardiac structural phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying developmental liabilities in lead compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection and cardiac anatomy identification.
- Dependent on epifluorescent microscopy with appropriate filter sets for tdTomato detection.
- Necessitates standardization of embryo staging and heart isolation procedures across users.
- Involves adaptation considerations when applying to different fluorescent reporter lines with varying expression patterns.
- Limited by the need for embryonic tissue access, restricting use to ex vivo developmental studies.
