طريقه خاليه من الانزيمات للعزل والتمدد للخلايا الجذعية الدهنية المستمدة من الدهون البشرية
ديسمبر 16, 2019
يوفر هذا البروتوكول طريقه خاليه من الانزيمات لعزل الخلايا الجذعية المسمارية من البطن والعينات الشحمية باستخدام طريقه الشرح. عدم وجود الانزيمات القاسية أو الخطوات طرد يوفر للخلايا الجذعية ذات الصلة سريريا التي يمكن استخدامها للدراسات في المختبر أو نقلها مره أخرى إلى العيادة.
يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة فعالة من حيث التكلفة لعزل ASCs دون استخدام إنزيمات قاسية أو خطوات الطرد المركزي ، والتي يمكن أن تغير النمط الظاهري للخلية والسلوك. عدم وجود خطوات قاسية تعطي خلايا أقل التلاعب من تلك المعزولة باستخدام الانزيمات والطرد المركزي، والتقليل من الأسئلة حول ما إذا كانت الملاحظات التجريبية هي قطعة أثرية من طريقة العزل. يمكن لهذه الطريقة explant توليد السريرية ذات الصلة ASCs ليتم إدخالها إلى المريض لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض أو توسيع في تطبيقات البحوث تحمل الحياة.
من الصعب شرح طريقة الرمز بالكلمات. يمكن أن تخدم العرض التوضيحي المرئي العلماء الآخرين متاعب تعلم تفكيك الأنسجة نفسها. ويمكن استخدام أساليب مماثلة لعزل مجموعات أخرى من الفئات السكانية الأخرى من الفئات الأخرى مثل تلك التي تُستخدم في الأنسجة السرّية.
ل mince عينات الأنسجة abdominoplasty، نقل أولا الأنسجة إلى غطاء لوحة 100 ملليمتر معقمة. ثم استخدم إبرة معقمة لعقد قطعة من الأنسجة في مكانها واستخدام مشرط معقمة لقطع الأنسجة إلى أقل من قطعة ملليمتر واحد. نقل الأنسجة إلى أنبوب جديد وعكس أو هز العينة من خمس إلى ست مرات لضمان خلط جميع الطبقات.
ثم, مع ملعقة معقمة, نقل 2.5 إلى خمسة ملليلتر من الأنسجة إلى 100 ملليمتر فراغ البلازما الغاز معالجة الأنسجة لوحة. قياس حجم العينة عن طريق صب في أنبوب جديد للطرد المركزي. بعد ذلك، إضافة حجم مكافئ من وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة إلى لوحة ودوامة بلطف لوحة لخلط المحتويات.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في خمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون حتى ينظر إلى عدد كاف من الخلايا على قاعدة لوحة. مرة واحدة لوحظ عدد كاف من الخلايا على لوحة أو بعد سبعة أيام، أيهما أقرب، وإزالة جميع القطع المتبقية من الأنسجة. بعد ذلك ، ثقافة ASCs في وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة حتى تصل إلى 70 ٪ التقاء أو حتى تصبح المجموعات كثيفة في هذه النقطة الخلايا التي يجب أن يتم تمريرها.
شطف بلطف لوحة مع 1X الفوسفات المخزنة المالحة. لstepsinize الخلايا الملتصية، وpirate المالحة الفوسفات المخزنة، إضافة ملليلتر واحد من التربسين تستكمل مع 0.25٪ EDTA إلى كل لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إضافة كمية صغيرة من الوسائط إلى لوحة لإلغاء تنشيط التربسين.
ثم الماصات بلطف التربسين وسائل الإعلام من أعلى لوحة إلى أسفل، فقدان أي خلايا ضعيفة تعلق من لوحة. لزرع الخلايا، أولا إضافة وسائل الاعلام إلى لوحة. ثم، إضافة الخلايا بطريقة قطرة ثم دوامة لوحة لضمان التوزيع حتى عبر لوحة.
بعد ثلاثة مقاطع، انتقل إلى تدفق قياس الخلايا والتمايز. بعد ثلاثة مقاطع، تم العثور على ASCs معزولة من عينات lipoaspirate وبضمين البطن أن يكون مورفولوجيا MSC وphenotype، على غرار ASCs المعزولة بعد الهضم الأنزيمي. مثل غيرها من MSCs، واكسونل المعزولة ASCs سلبية لـ CD45 وإيجابية لـ CD73 و CD90 و CD105.
عند تحديد النسيج، يجب أن تكون مساحة سطح كل قطعة كبيرة بما يكفي لـ ASCs للهجرة من الأنسجة. هذه هي الخلايا الجذعية الأساسية التي يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التطبيقات. ويمكن استخدام ASCs المعزولة لأي تطبيق المصب، في الجسم الحي أو في المختبر.
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة خالية من الإنزيمات لعزل الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ASCs) من عينات عمليات تجميل البطن وشفط الدهون باستخدام تقنية الاستنبات النسيجي (explant technique). يقلل هذا النهج من التعامل المباشر مع الخلايا، مما يضمن الحصول على خلايا جذعية ذات صلة سريريًا ومناسبة لمختلف التطبيقات.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الطب التجديدي
- تقنيات عزل الخلايا
خلفية علمية
- غالبًا ما تتضمن الطرق التقليدية لعزل الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهني (ASCs) استخدام إنزيمات قوية وعمليات طرد مركزي.
- يمكن لهذه الطرق أن تغير النمط الظاهري للخلايا وسلوكها.
- توفر طريقة الاستئصال (explant method) بديلًا أكثر رفقًا.
- يمكن للتوضيحات المرئية أن تساعد في فهم عملية تقطيع الأنسجة.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهني (ASCs).
- تقليل مخاطر حدوث شوائب في الملاحظات التجريبية الناتجة عن تقنيات العزل القاسية.
- توليد خلايا جذعية مشتقة من النسيج الدهني (ASCs) ذات صلة سريرياً للتطبيقات العلاجية.
الطرق المستخدمة
- يتم استنبات أنسجة عملية شد البطن المفرومة في طبق زراعة الأنسجة.
- تُحضن الخلايا عند 37°C في بيئة CO2.
- بعد نمو الخلايا بشكل كافٍ، يتم إزالة قطع الأنسجة المتبقية.
- يتم تمرير الخلايا وتوصيفها للتحقق من واسمات الخلايا الجذعية.
النتائج الرئيسية
- تظهر الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهني (ASCs) المعزولة شكلاً ظاهرياً ونمطاً ظاهرياً مماثلاً لتلك التي تم الحصول عليها عن طريق الهضم الإنزيمي.
- تكون الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهني المعزولة بطريقة القطع النسيجي سلبية لـ CD45 وإيجابية لـ CD73 و CD90 و CD105.
- تنتج هذه الطريقة خلايا أقل تعرضاً للمعالجة، مما يعزز الموثوقية التجريبية.
- يمكن استخدام الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهني في تطبيقات متنوعة لاحقاً، سواءً داخل الجسم (in vivo) أو خارج الجسم (in vitro).
الاستنتاجات
- تعد طريقة المستنبت (explant method) بديلاً فعالاً لعزل الخلايا الجذعية السدوية (ASCs).
- تحافظ هذه التقنية على خصائص الخلايا بشكل أفضل من الطرق التقليدية.
- تمتلك الخلايا الجذعية السدوية (ASCs) المعزولة إمكانات واسعة في الأبحاث والتطبيقات السريرية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
تعالج طريقة العزل هذه الخالية من الإنزيمات تحدياً رئيسياً في الطب التجديدي: وهو الحصول على خلايا جذعية ميزنشيمية ذات صلة سريرياً دون إدخال شوائب أو آثار ناتجة عن المعالجة الإنزيمية أو الميكانيكية القاسية. ومن خلال الحفاظ على النمط الظاهري والوظيفة الطبيعية للخلايا، يعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في التطبيقات اللاحقة مثل نمذجة الأمراض والفحص العلاجي. كما تدعم هذه الطريقة سير عمل الاكتشاف المبكر حيث تعتمد عملية تقليل المخاطر البيولوجية والتحقق من الأهداف على مصادر خلوية موثوقة وأقل تعرضاً للمعالجة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استجواب الفرضيات العلاجية باستخدام الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية مع الحفاظ على تعدد القدرات وملفات تعريف الواسمات السطحية.
- القيمة التشغيلية: تقلل من التباين في النتائج التجريبية عن طريق التخلص من التغيرات المظهرية الناجمة عن الإنزيمات.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال توليد خلايا أقل تعرضاً للمعالجة من أجل فحوصات التحقق من الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج خلايا جذعية مشتقة من الأنسجة الدهنية مناسبة للمقايسات القياسية في المختبر التي تتطلب أنماطاً ظاهرة ميزنكيمية متسقة.
- القيمة التشغيلية: تسهيل جاهزية المقايسات من خلال التوسيع القائم على المستأصلات الذي يحافظ على إيجابية CD73 وCD90 وCD105.
- القابلية للتوسع: دعم إنتاج خلايا قابل للتكرار لغرض فحص المركبات والدراسات الميكانيكية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يوفر مصدراً خلوياً ذا صلة سريرياً يتماشى مع تطبيقات الطب التجديدي.
- نموذج قبل سريري: يتيح توليد خلايا جذعية مشتقة من الأنسجة الدهنية لأنظمة ذات صلة بالأمراض دون التعرض لإنزيمات غريبة.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يقلل من المخاوف المتعلقة بآثار العزل الاصطناعية التي قد تؤثر على تقييمات التمايز أو الوظيفة التعديلية المناعية.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءًا من العزل المبكر للخلايا الجذعية وصولاً إلى التحقق قبل السريري، مما يدعم مسارات العمل التي تؤثر فيها سلامة مصدر الخلايا على موثوقية البيانات وقرارات المضي قدماً في التجربة أو إيقافها.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال توفير خلايا جذعية مشتقة من الأنسجة الدهنية ذات شكل وظواهر طبيعية.
- الفحص: توفر خلايا موحدة وجاهزة للتوسيع لمنصات المقايسة التي تتطلب خصائص الخلايا السدوية الميزنشيمية.
- التحليلات: تمكن من إجراء قياس التدفق الخلوي ومقايسات التمايز بعد ثلاثة ممرات لتأكيد هوية الخلايا الجذعية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط عملية العزل بالإمكانات العلاجية من خلال الحفاظ على الخصائص الخلوية ذات الصلة سريرياً.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس لمنصة قابلة لإعادة الاستخدام وخالية من الإنزيمات لإنتاج الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية عبر المشاريع المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية من خلال تقليل الآثار الاصطناعية الناتجة عن العزل في تجارب الخلايا الجذعية.
- القيمة التشغيلية: توفر بروتوكولاً بسيطاً وفعالاً من حيث التكلفة دون الاعتماد على الإنزيمات باهظة الثمن أو عملية الطرد المركزي.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال زيادة الثقة في نتائج المقايسات القائمة على الخلايا.
- تأثير المحفظة: تدعم التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال توفير خلايا جذعية ميزنكيمية موثوقة للتقييم قبل السريري.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب استخدام تقنية التعقيم والمعدات الأساسية لزراعة الأنسجة من أجل الفرم الميكانيكي وزراعة الأجزاء النباتية المستأصلة.
- يعتمد على أدوات معقمة تشمل المشارط والإبر والملعقات لتحضير الأنسجة.
- يستلزم ظروف تحضين معيارية عند 37°C مع 5% CO2 لتحقيق النمو الخلوي الأمثل.
- يتضمن نقل الخلايا يدويًا بناءً على درجة التلاقي أو كثافة التجمعات بعد الإزالة الأولية للأنسجة.
- يعتمد على قياس التدفق الخلوي ومقايسات التمايز للتأكيد المظهري بعد عملية العزل.
