Name: إجراءات التشغيل الموحدة لمراقبة فيروس ليسا لسكان الخفافيش في تايوان (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: تعلم إجراءات مراقبة فيروس ليسا في الخفافيش بتايوان باستخدام اختبارات الأجسام المضادة الفلورية والتحليل الجزيئي. يوفر هذا البروتوكول دليلاً موحدًا للباحثين لدراسة الأمراض الحيوانية المنشأ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونشكر تيان - تشنغ لي، ويي - تانغ لين، وشيا - جونغ تساي، ويا لان لي على مساعدتهم خلال هذه الدراسة. وقد تم دعم هذه الدراسة بمنحة رقم 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) من مكتب التفتيش على صحة الحيوان والنبات والحجر الصحي، مجلس الزراعة، يوان التنفيذي، تايوان.

1. احتياطات السلامة عند التعامل مع الفيروسات الليسافيروسية
<ol><li>التأكد من أن جميع العاملين في المختبرات الذين يتعاملون مع عينات الخفافيش يتلقون الوقاية من داء الكلب قبل التعرض17. مراقبة مستويات الأجسام المضادة لداء الكلب من العمال مسبقا وإعادة فحصها كل 6 أشهر17. مطلوب متابعة التطعيم ضد داء الكلب لأولئك الذين مستويات الأجسام المضادة أقل من 0.5 وحدة IU/مل17.</li>
	<li>اعتمادا على أنظمة السلامة الأحيائية في البلد الذي يوجد فيه المختبر، تأكد من تنفيذ الإجراءات التالية في مختبرات مناسبة على مستوى السلامة الأحيائية (مثل مختبرات BSL-2 في تايوان ومختبرات BSL-3 في أستراليا)، وأن العمال مؤهلون حاليا وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة18. ملاحظة: التطعيم داء الكلب يوفر القليل من الحماية أو لا يمكن أن تكون من الفيروسات التي تنتمي إلى فيلوالمجموعات الثانية والثالثة18. ويجب إبلاغ العمال بأنه تم تحديد العديد من مسببات الأمراض الحيوانية في الخفافيش19 وينبغي أن تعالج العينات في ظل ظروف مختبرية مناسبة على مستوى السلامة الأحيائية مع معدات وقائية شخصية مناسبة.</li>
</ol>2. جمع عينة
<ol><li>استخدام وجدت الخفافيش ضعيفة أو مريضة أو الذبيحة. ملاحظة: يتم تسليم الخفافيش الضعيفة أو المريضة إلى جمعية حفظ الخفافيش في تايبيه للرعاية البيطرية أو البحوث، في حين يتم تقديم الذبيحة مباشرة إلى معهد بحوث صحة الحيوان. لم يتم قتل أي خفافيش صحية في برنامج المراقبة هذا.</li>
	<li>يكون عالم البيئة الخفافيش تحديد أنواع الخفافيش من خلال الخصائص المورفولوجية20.</li>
	<li>إجراء ترميز الحمض النووي من أنواع الخفافيش عندما يتم تشخيص lyssavirus إيجابية، وذلك باستخدام الإجراءات المنشورة سابقا21.</li>
	<li>تقديم ورقة معلومات عن كل جيفة الخفافيش (موقع جمع، والأنواع، والعلامات السريرية، وما إلى ذلك).</li>
</ol>3. المحاصيل من عينات الخفافيش
<ol><li>إعداد المواد.<ol>
<li>إعداد لوحة تشريح نظيفة ووضع وسادة ماصة معقمة لnecropsy.</li>
		<li>إعداد أنابيب جمع لجمع أجهزة الخفافيش.</li>
		<li>إعداد ملاقط المتاح ومشرط لnecropsy. تغيير الأدوات بين necropsy كل الخفافيش. إعداد كرات القطن مبللة مع الإيثانول 70٪ لتنظيف ملاقط ومشرط أثناء أخذ العينات.</li>
		<li>إعداد اثنين من الشرائح المجهر لFAT. جمع عينات جديدة وإصلاحها في حل رسمي لفحص الأنسجة المرضية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>فحص جميع الفتحات الخارجية قبل necropsy. تصوير السمات الخارجية للخفافيش، وخاصة الرأس والأذنين والأجنحة، لتمايز الأنواع.</li>
	<li>جمع عينة مسحة عن طريق الفم. وضع الخفافيش في recumbency البطني على متن الطائرة وإصلاح رأس الخفافيش مع ملاقط. قطع الجلد على طول خط الوسط من calvaria مع مشرط وسحب الجلد إلى الجانبين الجانبي. قطع الجمجمة على طول خط الوسط من calvaria مع مشرط وفتحه مع ملاقط لفضح أنسجة الدماغ.</li>
	<li>إزالة أنسجة الدماغ من الجمجمة ووضعها على الاكتئاب اللسان المعقمة، وجعل مسحات الانطباع من أنسجة الدماغ (انظر الخطوة 4.2). جمع قطعة صغيرة من أنسجة الدماغ الطازجة وإصلاحه في formalin لفحص الأنسجة المرضية. احتواء أنسجة الدماغ المتبقية في أنبوب لاستخراج الحمض النووي.</li>
	<li>ملاقط نظيفة ومشرط مع كرات القطن مبللة مع الإيثانول 70٪ لإزالة الأنسجة المحتفظ بها بين جمع العينات.</li>
	<li>وضع الخفافيش على متن الطائرة في recumbency الظهرية وإصلاحه على متن الطائرة مع الإبر على جانبي axilla وكعب الذيل.</li>
	<li>نأي الجلد على طول خط الوسط من الجسم من الفك السفلي إلى فتحة الشرج. رفع وفصل الجلد والأنسجة العضلية الكامنة مع ملاقط. جمع الغدد اللعابية، والتي هي بالقرب من العظام الفكالسفلي.</li>
	<li>رفع القص قليلا مع ملاقط، وقطع القص وجدار البطن على طول خط الوسط مع مشرط. قطع الترقوة مع مشرط. إصلاح أقفاص الضلع الأيسر والأيمن إلى المجلس مع الإبر لفتح تجويف الصدر.</li>
	<li>تسجيل الآفات الإجمالية ودرجة التغيير بعد الوفاة.</li>
	<li>إزالة الأنسجة الحشوية (أي القلب والرئتين والكبد والكلى والأمعاء) من الذبيحة باستخدام ملاقط ومشرط. جمع العينات الحشوية حسب الحاجة للبحوث في المستقبل. ملاحظة: من المستحسن جمع عينات مكررة. وينبغي جمع واحد للتشخيص الجزيئي، والآخر ينبغي تجميدها في -80 درجة مئوية مع أو بدون وسيلة نقل الفيروسية للثقافة الفيروسية22.</li>
</ol>4. اختبار الأجسام المضادة الفلورسنت المباشر (FAT)
<ol><li>جعل مسحات الانطباع من أنسجة الدماغ لFAT. تنفيذ FAT كما هو موضح سابقا18،23 مع التعديلات التالية.</li>
	<li>قم بفصل أنسجة الدماغ بلطف عن الأنسجة العصبية المتصلة بملاقط ونقل أنسجة الدماغ إلى مُقِّب لللسان المعقمة. قطع المقطع العرضي من الدماغ، بما في ذلك جذع الدماغ والمخيخ18،23. جعل مسحات الانطباع من أنسجة الدماغ عن طريق لمس طفيفة سطح قطع أنسجة الدماغ، واضغط على الشريحة على أنسجة العدسة لإزالة الأنسجة الزائدة.</li>
	<li>إصلاح الشرائح مع الأسيتون في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>استخدام كل من اثنين من الأجسام المضادة المضادة لداء الكلب FITC المترافقة تجاريا لتلطيخ مستضد فيروس ليسا ينصح بشدة23. تحديد تركيز العمل من المتقارن ة التجارية قبل تلطيخ الأول. إسقاط الكدمات المخففة من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر على الشرائح واحتضان الشرائح في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة داخل غرفة رطبة.</li>
	<li>قم بتجفيف المتقارنالزائد من الشرائح واغسل الشرائح بمحلول ملحي مُسحّص بالفوسفات (PBS) بعد الحضانة.</li>
	<li>إسقاط كمية صغيرة من الجلسرين 10٪ على الشرائح وتغطية مع الشرائح غطاء.</li>
	<li>فحص الشرائح مع المجهر الفلورسنت.</li>
</ol>5. استخراج الحمض النووي
<ol><li>إضافة الحجم المناسب من MEM-10 (الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية المكملة مع 10٪ مصل البقر الجنيني) إلى أنسجة الدماغ (10٪ ث / الخامس).</li>
	<li>تجانس أنسجة الدماغ مع حبة الصلب 5 مم في أداة المجانسة والطرد المركزي في 825 × ز لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>استخراج حمض النووية، والحجم النهائي منها هو 50 درجة مئوية، في غضون 200 درجة مئوية من supernatant باستخدام مجموعة استخراج حمض نووي الكلي المتاحة تجاريا مع أداة.</li>
</ol>6. RT-PCR والتحليل الجيني
ملاحظة: تم نشر عدة مجموعات التمهيدي للكشف عن كافة الفيروسات lyssaالمعروفة أو lyssaviruses محددة. البروتوكول الموصوف هنا هو مثال يستخدم مختبرنا وقد لا يناسب جميع الاحتياجات التجريبية. حدد التمهيديات المناسبة وفقا لاحتياجات المختبر.
<ol><li>إعداد الكاشف RT-PCR من خطوة واحدة على النحو التالي: إضافة 5 ميكرولتر من حمض نووي المستخرج إلى خليط التفاعل الذي يحتوي على 2.5 ميكرولتر من 10X احتياطي التفاعل، 0.5 ميكرولتر من التمهيديات الأمامية والعكسية (10 ميكرومتر لكل منهما)، 4 ميكرولتر من 1.25 مليون متر من الدنتب، 0.3 ميكرولتر من مثبطات RNase (40 U/μL) ، 0.3 ميكرولتر من النسخ العكسي (10 U/μL)، و0.4 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي (5 U/μL)، و 11.5 ميكرولتر من المياه المعالجة بـ DEPC. ملاحظة: مجموعة التمهيدي المستخدمة في هذا البروتوكول هو JW12 (5 '-ATGTACACCYCTACAATG-3') و N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. تعديل إعداد الكواشف وظروف ركوب الدراجات وفقا لمجموعات التمهيدي المستخدمة.</li>
	<li>أداء ركوب الدراجات في ظل الظروف التالية: الحضانة في 42 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة; النُضر الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 s, 55 °C ل 30 s, و 72 °C ل 30 s; وأخيرا، مزيد من التمديد في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.</li>
	<li>استخدام مجموعة أخرى أو أكثر التمهيدي لزيادة حساسية التشخيص.<ol>
<li>استخدام N113F (5'-GTAGGGTTATATGGG-3') و N304R (5'-TTGACGAGAATCTTTCTCAT-3')25،26 لإعداد الكاشف RT-PCR خطوة واحدة على النحو التالي: إضافة 5 ميكرولتر من حمض نووي المستخرجة إلى خليط رد فعل يحتوي على 5 ميكرولتر من 10X العازلة، 5 ميكرولتر من التمهيديات الأمامية والعكسية (4 ميكرومتر لكل منها)، 5 ميكرولتر من 1.25 مليون متر من الدنتوب، 0.5 ميكرولتر من مثبطات RNase (40 U/μL)، 0.2 ميكرولتر من النسخ العكسي (10 U/μL)، 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي (5 U/μL)، و23.3 ميكرولتر من المياه المعالجة بـ DEPC.</li>
		<li>أداء ركوب الدراجات في ظل الظروف التالية: الحضانة في 42 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة; النُضر الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 20 درجة، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ وأخيرا، مزيد من التمديد في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: اعتمادا على الاحتياجات المختبرية، واختيار التمهيديات المناسبة للتشخيص. تم تصميم N113F في الأصل لتضخيم فيروس داء الكلب، ولكن قد لا تعمل بشكل جيد لفيروسات lyssas الأخرى. مجموعة من N113F و N304R يعمل بشكل جيد لفيروس داء الكلب (تايوان النمس الغرير البديل) وتايوان الخفافيش lyssavirus. سيكون من الأسهل الحصول على تسلسل البروتين النووي كله باستخدام مجموعة من التمهيديات JW12 و N304R إذا تم تضخيم ليسافيروس من قبل كل من اثنين من مجموعات التمهيدي أعلاه.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحليل المنتج PCR على 2٪ الأوروز جل الكهربائي وتصور من قبل الأشعة فوق البنفسجية الإضاءة الخفيفة.</li>
	<li>تسلسل المنتج PCR حسب خدمة التسلسل التجاري.</li>
	<li>أدخل أو حمّل التسلسل إلى صفحة ويب أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST). حدد قاعدة البيانات "الآخرين (NR الخ)" وأدخل الكائن الحي كفيروس Lyssavirus. حدد خوارزمية MegaBlast وتشغيل BLAST.</li>
</ol>7. فيروس العزلة
ملاحظة: تنفيذ عزل الفيروس عند إما 1) FAT أو 2) يشير RT-PCR الإيجابية.
<ol><li>تجانس عينة الدماغ في تعليق 10٪ (ث / الخامس) في MEM-10. الطرد المركزي في 825 × ز لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>تلقيح 200 درجة مئوية من supernatant مع تعليق 3 × 106 MNA (الماوس ورم الخلايا العصبية) الخلايا في 1 مل من MEM-10 لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع 1٪ CO2. نقل تعليق الدماغ خلية متجانسة إلى قارورة 25 سم2 وإضافة 6 مل من MEM-10.</li>
	<li>زراعة 1 مل من الدماغ تعليق خلية متجانسة في 4 الشريحة الزجاجية المغلفة تفلون جيدا مع قطر 6 ملم في نفس الوقت.</li>
	<li>بعد 3-4 أيام من الحضانة في 37 درجةمئوية مع 1٪ CO 2، إصلاح الخلايا على الشريحة 4 جيدا مع الأسيتون 100٪ (v / v).</li>
	<li>وصمة عار الشرائح مع اثنين من الأجسام المضادة لداء الكلب FITC المترافقة بعد الخطوات 4.4-4.7. يتم إصابة الخلايا عندما يتم التحقيق في التضمينات intracytoplasmic. تسجيل النسبة المئوية للخلايا المصابة.</li>
	<li>إجراء التغريب والثقافة الفرعية لثقافة الخلية الملقحة عندما تكون الشرائح ملطخة بالسالبة:<ol>
<li>إزالة المتوسطة وشطف قارورة مع 5 مل من PBS.</li>
		<li>إضافة 1 مل من التربسين إلى قارورة وضرب بحزم الجزء السفلي من قارورة.</li>
		<li>إضافة 6 مل من MEM-10 وإعادة تعليق الخلايا.</li>
		<li>وضع تعليق الخلية في قارورة الأنسجة الجديدة (6 مل) وعلى شريحة 4 جيدا (1 مل).</li>
	</ol>
</li>
	<li>كرر الخطوات 7.4-7.6 حتى يتم الوصول إلى العدوى 100%.</li>
	<li>جمع supernatant بعد 24 ساعة من الحضانة.</li>
</ol>

<ol><li>Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuzmin%2C+IV+%22Current+laboratory+techniques+in+rabies+diagnosis%2C+research%2C+and+prevention%2C+volume+1%22">Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1</a>. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).</li>
<li>Aréchiga Ceballos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lyssavirus+in+bat%2C+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel lyssavirus in bat, Spain.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).</li>
<li>Gunawardena, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Indian+Flying+Foxes%2C+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).</li>
<li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li>
<li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+Emerging+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li>
<li>Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+bats%3A+emergence+and+zoonotic+threat%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat.</a> Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).</li>
<li>Pal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+infection+of+a+flying+fox+bat%2C+Pteropus+policephalus+in+Chandigarh%2C+Northern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India.</a> Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).</li>
<li>Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rabies+virus+from+fruit+bats+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand.</a> Nature. 216 (5113), 384(1967).</li>
<li>Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+dogs+in+rabies+transmission%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of dogs in rabies transmission, China.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses+%28Aravan+and+Khujand%29+from+Central+Asia%3A+phylogenetic+relationships+according+to+N%2C+P+and+G+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences.</a> Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).</li>
<li>Arguin, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+Lyssavirus+infections+among+bats%2C+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).</li>
<li>Lumlertdacha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+for+bat+lyssaviruses%2C+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Survey for bat lyssaviruses, Thailand.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+surveillance+in+bats%2C+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).</li>
<li>Reynes, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+lyssavirus+infection+in+bats%2C+Cambodia%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses%2C+northern+Vietnam%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses, northern Vietnam.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).</li>
<li>Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Irkut+virus+from+a+Murina+leucogaster+bat+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097(2013).</li>
<li>Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaplan%2C+MM+%22Laboratory+Techniques+in+Rabies%2C+4th+Ed%22">Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).</li>
<li>World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf">http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf</a> (2019).</li>
<li>Smith, I., Wang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bats+and+their+virome%3A+an+important+source+of+emerging+viruses+capable+of+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).</li>
<li>Corbet, G. B., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorbet%2C+GB+%22The+mammals+of+the+Indomalayan+region%3A+a+systematic+review%22">The mammals of the Indomalayan region: a systematic review</a>. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).</li>
<li>Mayer, F., von Helversen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+diversity+in+European+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryptic diversity in European bats.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).</li>
<li>Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEpstein%2C+JH+%22Bats+and+viruses%3A+a+new+frontier+of+emerging+infectious+diseases%22">Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases</a>. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2019).</li>
<li>Hayman, D. T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li>
<li>Franka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+phylogenetic+lineage+of+rabies+virus+associated+with+western+pipistrelle+bats+%28Pipistrellus+hesperus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus).</a> Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).</li>
<li>Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrimarchi%2C+CV+%22Rabies%2C+1st+ed%22">Rabies, 1st ed</a>. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).</li>
<li>Moldal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+detection+of+European+bat+lyssavirus+type+2+%28EBLV-2%29+in+Norway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway.</a> BMC Veterinary Research. 13, 216(2017).</li>
<li>Robardet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assay+of+fluorescent+antibody+test+results+among+twelve+European+National+Reference+Laboratories+using+various+anti-rabies+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates.</a> Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).</li>
<li>Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanlon%2C+CA+%22Rabies%2C+3rd+ed%22">Rabies, 3rd ed</a>. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).</li>
<li>Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step+forward+in+molecular+diagnostics+of+lyssaviruses--results+of+a+ring+trial+among+European+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58372(2013).</li>
<li>David, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+detection+by+RT-PCR+in+decomposed+naturally+infected+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.</a> Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).</li>
<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

ولا يُعلن عن أي تضارب في المصالح.

يوفر إجراء التشغيل القياسي المختبري (SOP) عملية تسلسلية لاختبار عينات الخفافيش لوجود مستضدات فيروس ليسا في تايوان. وتشمل الخطوات الرئيسية توظيف FAT وRT-PCR. ومن المهم أيضا اختيار العينات المناسبة والعزل الناجح للفيروس. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء مراقبة lyssaviruses الخفافيش. وكان الفرق الرئيسي هو الحيوانات المستهدفة. في البداية (2008-2009)، كانت الحيوانات المستهدفة من مراقبة فيروس الخفافيش الخفافيش الخفافيش الحية، التي حوصرت في جزيرة كينمن في تايوان ثم اختبارها للفيروس الليسا بعد القتل ...

الفيروسات داخل جنس Lyssavirus هي مسببات الأمراض الحيوانية. هناك ما لا يقل عن سبعة أنواع فيروس ليسا المرتبطة الحالات البشرية1. بالإضافة إلى 16 نوعا في هذا الجنس1،2،3، تايوان الخفافيش lyssavirus (TWBLV)4 وKotalahti الخفافيش lyssavirus5 تم تحديدها مؤخرا في الخفافيش ، ولكن حالاتها التصنيفية لم يتم تحديدها.
الخفافيش هي المضيفين الطبيعيين لمعظم الفيروسات الليسافية، باستثناء موكولا ليسافيروس وإيكوما ليسافيروس، والتي لم يتم تحديدها حتى الآن في أي الخفافيش1،2،3،6. لا تزال المعلومات المتعلقة بالفيروسات الليسافية في الخفافيش الآسيوية محدودة. تم الإبلاغ عن اثنين من الفيروسات lyssasaغير مميزة في الخفافيش الآسيوية (واحد في الهند والآخر في تايلاند)7،8 تم الإبلاغ عنها. تم الإبلاغ عن حالة واحدة من حالات داء الكلب البشري المرتبطة لدغة الخفافيش في الصين في عام 2002، ولكن تم التشخيص فقط عن طريق المراقبة السريرية9. في آسيا الوسطى، تم التعرف على فيروس أرافان ليسا في الخفافيش أقل ماوس الأذنين(Myotis blythi)في قيرغيزستان في عام 1991، وتم التعرف على فيروس Khujand lyssa في الخفافيش شعيرات (Myotismystacinus)في طاجيكستان في عام 200110. في جنوب آسيا، تم التعرف على Gannoruwa الخفافيش lyssavirus في الثعلب الطائر الهندي(Pteropus medius)في سري لانكا في عام 20153. في جنوب شرق آسيا، أظهرت العديد من الدراسات المصلية على الخفافيش في الفلبين وتايلاند وبنغلاديش وكمبوديا وفيتنام الانتشار المصلي المتغير11،12،13،14، 15. على الرغم من أنه تم التعرف على فيروس إركوت ليسا في الخفافيش أكبر أنبوب أنف(مورينا leucogaster)في مقاطعة جيلين، الصين في عام 201216،لا تزال الأنواع بالضبط ومواقع lyssaviruses في مجموعات الخفافيش شرق آسيا غير معروفة.
ولتقييم وجود فيروس الليسا في مجموعات الخفافيش التايوانية، بدأ تنفيذ برنامج مراقبة يستخدم كلا ً من فيروس FAT المباشر وRT-PCR. تم التعرف على فيروس الخفافيش التايوانية في حالتين من البيبيسترلي الياباني(Pipistrellus abramus)4 في 2016-2017. في هذه المقالة، يتم إدخال إجراء تشغيل قياسي مختبري لمراقبة فيروس الليسا لسكان الخفافيش في تايوان. يتم عرض الرسم البياني لتدفق تشخيص فيروس الخفافيش في مختبرنا في الشكل 1.

<table><tbody><tr><td>2.5٪ تربسين (10x)</td> <td>جيبكو</td><td>15090046</td><td>التربسين</td></tr><tr><td>25 سم 2 قارورة</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>VWR Life Science</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>الكحول</td><td>كاشف NIHON SHYAKU</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV النسخ العكسي</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X) &nbsp;</td><td>جيبكو</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>بليد</td><td>براون</td><td>BA215</td><td></td></tr> جهاز <tr><td>طرد مركزي</td><td>eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>نظام التلألؤ الكيميائي</td><td>TOP BIO CO.</td><td>MGIS-21-C2-1M</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب جمع</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>غطاء الشريحة</td><td>Muto Pure Chemical Co.، LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>محلل الحمض النووي</td><td>الأنظمة الحيوية التطبيقية</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>جيبكو</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC مكافحة داء أحادي النسيلة الجلوبيولين</td><td>Fujirebio Diagnostic Inc.</td><td>800-092</td><td>الأجسام المضادة لداء المترافقة FITC: الكاشف B</td></tr><tr><td>شريحة زجاجية مطلية بالتفلون بأربعة آبار</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr> نظام <tr><td>الرحلان الكهربائي للجل</td><td>العلوم الرئيسية</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td> <td>حاضنة Gibco</td><td>14175095</td><td>التربسين</td></tr><tr><td></td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مقلوب</td><td>أوليمبوس</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-جلوتامين 200 ملي مولار (100x)</td> <td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>LIGHT DIAGNOSTICS كاشف داء الدهنية</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>الأجسام المضادة لداء المترافقة FITC: الكاشف A</td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact Instrument</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td> <td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td> <td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM محلول فيتامين</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>إبرة</td><td>Terumo</td><td>NN * 2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>توليف التمهيدي</td><td>مهمة Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasin ريبونوكلياز مثبط</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>خدمة التسلسل</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>حبات الفولاذ المقاوم للصدأ</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>وسادة ماصة معقمة</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>مرشح حقنة</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>خافض اللسان</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td>122246</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط</td><td>تينيسون للأدوات الطبية لتطوير الشركة المحدودة.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>تايلوسين طرطرات</td><td>سيجما</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

إجراءات التشغيل الموحدة لمراقبة فيروس ليسا لسكان الخفافيش في تايوان

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

الفيروسات داخل جنس Lyssavirus هي مسببات الأمراض الحيوانية، ويرتبط ما لا يقل عن سبعة أنواع فيروس ليسا مع الحالات البشرية. لأن الخفافيش هي الخزانات الطبيعية لمعظم الفيروسات الليسافية، وقد تم تنفيذ برنامج مراقبة فيروس ليسا من الخفافيش في تايوان منذ عام 2008 لفهم بيئة هذه الفيروسات في الخفافيش. وفي هذا البرنامج، تعاونت المنظمات غير الحكومية المعنية بحفظ الخفافيش والمراكز المحلية لمكافحة الأمراض الحيوانية لجمع الخفافيش الميتة أو الخفافيش التي تموت بسبب الضعف أو المرض. تم الحصول على أنسجة الدماغ من الخفافيش من خلال المحاصيل الفلورية وإخضاعها لاختبار الأجسام المضادة الفلورسنت المباشر (FAT) والنسخ العكسي تفاعل البوليميراز سلسلة (RT-PCR) للكشف عن مستضدات فيروس ليسا والأحماض النووية. بالنسبة للدهون، يوصى باثنين على الأقل من التتقارنات المختلفة لتشخيص داء الكلب. بالنسبة لـ RT-PCR، تُستخدم مجموعتان من المواد التمهيدية (JW12/N165-146 وN113F/N304R) لتضخيم تسلسل جزئي لجين البروتين النووي للفيروس الليسا. يراقب برنامج المراقبة هذا الفيروسات الليسافيروسية وغيرها من العوامل الحيوانية في الخفافيش. تم العثور على فيروس الخفافيش التايوانية في حالتين من بيبيستريلي اليابانية(Pipistrellus abramus)في 2016-2017. وينبغي أن تبلغ هذه النتائج الجمهور والمهنيين الصحيين والعلماء بالمخاطر المحتملة للاتصال بالخفافيش وغيرها من الأحياء البرية.

في الفترة من عام 2014 إلى مايو 2017، تم جمع 332 جثة خفاش من 13 نوعاً للمراقبة. اثنين من اختبار إيجابي. في حالة الخفافيش الأولى، تم اختبار انطباع الدماغ سلبيًا باستخدام FAT مع أحد الأجسامالمضادة لداء الكلب التجاري المترافق ة في تَكْتَبَد (الشكل 2)، في حين أن ّ الـ RT-PCRs التي تستخدم كل من المجموعتين التمهيديتين (JW12/N165-146 وN113F/N304R) أسفرت عن نتائج إيجابية(الشكل 3). تم الحصول على تسلسل 428 نقطة أساس من amplicon (تضخيم مع N113F/N304R وتحتوي على جين البروتين...

يقدم هذا البروتوكول إجراء تشغيل مختبري قياسي للاختبار التشخيصي لمستضدات فيروس ليسا في الخفافيش في تايوان.

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

ليسافيروس هو مسببات الأمراض حديقة الحيوان لا تيك. لتقييم وجود فيروس ليسا في مجموعات الخفافيش التايوانية ، بدأنا برنامج مراقبة. ونجحت في تحديد أربعة فيروسات ليسا في 2016 إلى 2018.هذا البروتوكول هو مقدمة خطوة بخطوة لمراقبة فيروس vi-al Lyssa في تايوان. نأمل أن يكون من المفيد للبحوث المهتمة في vi-al Lyssavirus الترصد. من المهم توصيل رمز tac-keg الصحيح.الخفافيش الميتة أو المحتضرة هي أكثر ملاءمة من الخفافيش الحية لمراقبة فيروس ليسا. اعتمادا على أنظمة السلامة البيولوجية للبلد الذي يوجد فيه المختبر؛ تنفيذ الإجراءات التالية في مختبر مناسب على مستوى السلامة البيولوجية. والتأكد من أن الباحثين مؤهلون حالياً وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.عند جمع الخفافيش أو الذبائح الضعيفة أو المريضة ، يكون لديك عالم بيئة الخفافيش تحديد أنواع الخفافيش من خلال الخصائص المورفولوجية للعينة. تقديم ورقة معلومات إلى المختبر، بما في ذلك موقع التجميع والأنواع والعلامات السريرية وغيرها من البيانات ذات الصلة مع كل عينة من الخفافيش. قبل البدء في النيروسكوبي ، قم بفحص جميع الفوهات الخارجية وتصوير الخفافيش الميزات الخارجية ، وخاصة الرأس والأذنين والأجنحة لتمايز الأنواع.لجمع عينة مسحة عن طريق الفم وضع الخفافيش في إعادة شغل البطن على لوحة تشريح عقيمة وإصلاح الرأس مع ملاقط. استخدام مشرط لقطع الجلد على طول خط الوسط من منطقة العجل؛ وسحب الجلد إلى الجانبين الجانبي، لجعل شق في الجمجمة على طول خط الوسط من منطقة العجل. افتح الجمجمة بملاقاة لكشف أنسجة المخ واستخدم الملاقط لفصل أنسجة الدماغ عن النسيج العصبي المتصل برفق.قطع المقطع المقطع من الدماغ، بما في ذلك جذع الدماغ والمخيخ، ولمس طفيفة السطح قطع من أنسجة الدماغ مع الشرائح الزجاجية لجعل الانطباعات تشويه. اضغط على الشريحة على أنسجة العدسة لإزالة الأنسجة الزائدة وإصلاح الشرائح الانطباع مسحة في الأسيتون درجة مئوية ناقص 20 لمدة 30 دقيقة. ثم إصلاح قطعة صغيرة من أنسجة الدماغ الطازجة، في formalin، لفحص الأمراض الهدولوجية.ووضع بقية الأنسجة في emi-em 10 لاستخراج الحمض النووي. بعد ذلك، قم بتشريح الجلد من المتشعب إلى فتحة الشرج على طول خط الوسط في الجسم، واستخدم الملاقط لرفع وفصل الجلد وتسلط أنسجة العضلات؛للسماح بجمع الغدد اللعابية، الموجودة بالقرب من عظم المناديل. رفع قليلا القص مع ملاقط، واستخدام مشرط لقطع القص وجدار البطن على طول خط الوسط وقطع الترقوة.استخدام الإبر لإصلاح الأقفاص الصدرية اليمنى والأيسر إلى لوحة التشريح، لفتح تجويف الصدر. وسجل الجحافل الإجمالية ودرجة تغيير ما بعد الوفاة. ثم استخدم الملاقط والمشرط لإزالة الأنسجة الحشوية حسب الاقتضاء لتحليل المصب المخطط له.لإجراء اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة في نهاية التثبيت، قم بتجفيف شرائح الانطباع المسحة وحدد جسمين مضادين مضادين لداء الكلب الفلوري على الأقل للتحليل. قم بتميّز جسم مضاد واحد على كل شريحة من خلال مصفّر 0.45 ميكرومتر. واحتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.في نهاية الحضانة، استنزاف قبالة اقتران الزائدة وغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني. ثم استخدام حجم صغير من 10٪ الجلسرين لتركيب تغطية زلات على الشرائح وصورة الشرائح عن طريق المجهر الفلوريسنس. عندما يشير إما اختبار الأجسام المضادة الفلورية أو تحليل RT-PCR إلى الإيجابية، فإن التجانس بين عينة الدماغ في التعليق بنسبة 10٪في emi-en 10 ورواسب الأنسجة fleu-rry بواسطة الطرد المركزي.تلقيح 200 ميكرولترات من سوبر نات أون مع ثلاث مرات 10 لخلايا الورم الأرومي العصبي 6 الماوس ومليلتر واحد من emi-en 10 لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 1٪ ثاني أكسيد الكربون. ونقل تعليق خلايا الدماغ المتجانسة إلى قارورة مربعة 25 سنتيمترًا ، تحتوي على ستة ملليلترات من emi-en الطازجة 10. في ملليلتر واحد من تعليق خلايا الدماغ المتجانسة في شريحة زجاجية مغلفة بأربعة بلبيرات ، بقطر ستة ملليمترات ووضع الشريحة عند 37 درجة مئوية و 1٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.بعد التثبيت مع 100٪ الأسيتون، وصمة عار الشرائح مع نفس اثنين من الفلوريسنس مترافق الأجسام المضادة المضادة لداء الكلب كما تستخدم لاختبار الأجسام المضادة fluorescence. وتصور الشرائح بواسطة المجهر الفلورسنت لتحديد عدد من إدراجات intracida-plas-mic. بعد التربسينينغ وتربية الخلايا المستلقة و زراعة فرعية وفقا للبروتوكولات القياسية، والعودة إلى ثقافة الباردة حاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام أخرى مع تكرار العد من عدد الخلايا المصابة كما أظهرت فقط حتى يتم التوصل إلى 100٪ العدوى.وفي الفترة من كانون الثاني/يناير 2014 إلى أيار/مايو 2017، تم جمع 332 جثة من الخفافيش من 13 نوعاً من أجل المراقبة. في هذا التحليل التمثيلي لحالتين إيجابيتين من الخفافيش، تم اختبار انطباع الدماغ سلبيًا باستخدام اختبار الأجسام المضادة الفلورية مع أحد الأجسام المضادة المضادة المضادة لداء الكلب، ذات النوبة، في حين أن RT-PCR الذي يستخدم كل من المجموعتين التمهيديتين المختلفتين، أسفر عن نتائج إيجابية. وكشف إخضاع تسلسل ampli-con الذي تم الحصول عليه للاستعلام عن الانفجار في قاعدة بيانات بنك Gen أن التسلسل كان مشابهًا لفيروسات ليسيسا مع هويات أقل من 79٪ تدعم هويات فيروسات ليسا المكتشفة.تم عزل اثنين من الفيروسات Lyssa في وقت لاحق بنجاح من اثنين من العقول كما أكد اختبار الأجسام المضادة fluorescence وتسلسل. الخطوة الرئيسية لتحديد الإيجابية فيروس ليسا هي اختبار الأجسام المضادة fluorescence وتحليل RT-CPR. ينصح بشدة استخدام اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة لداء الكلب في مجموعات التمهيدي.بالإضافة إلى فيروس Lyssa أخرى حديقة الحيوان غير- الأمراض الخفافيش-ical يمكن رصدها باستخدام طرق التشخيص مغلقة. ويمكن بعد ذلك استخدام البيانات لإعلام الجمهور حول تجنب الاتصال مع الخفافيش. كلما تمكنا من دراسة فيروس الخفافيش ، كلما تمكنا من فهم تطوره وتأثيره على الصحة العامة.

standard-operating-procedure-for-lyssavirus-surveillance-bat

Research

JoVE Journal

Environment

البيئة

نقدم هنا، البروتوكولات لتحديد إيمونومودولاتورس 1) الفيروسات المشفرة التي تروج للنسخ المتماثل المفصليات وعوامل المضيف 2) حقيقية النواة التي تقيد المفصليات النسخ المتماثل. تسمح هذه الأساليب المستندة إلى الأسفار والتلألؤ الباحثين سرعة الحصول على قراءات الكمية من النسخ المتماثل المفصليات في فحوصات التبسيط مع انخفاض نسب الإشارات إلى الضجيج.

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

وقد وضعت لعموم lyssavirus النسخ العكسي تفاعل البلمره سلسله للكشف عن جميع الفيروسات المعروفة علي وجه التحديد. وأظهرت المصادقة باستخدام عينات الدماغ من داء المخ للأنواع الحيوانية المختلفة ان هذه الطريقة لها حساسية وخصوصية مكافئه لاختبار الأجسام المضادة الفلورية القياسية الذهبية ويمكن استخدامها للتشخيص الروتيني لداء البشر.

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

هذا هو بروتوكول لاعداد الانسجه الأمثل لالجينوم ، الناسخ ، وتحليلات بروتينيه من الخفافيش اشتعلت في البرية. وهو يتضمن بروتوكولات للتقاط الخفافيش والتشريح ، والحفاظ علي الانسجه ، والذبح الخلية من انسجه الخفافيش.

جمع الانسجه من الخفافيش للتحليلات الomics وثقافة الخلايا الاوليه

هذا في الوقت الحقيقي RT-PCR باستخدام صبغ dsDNA intercalating هو مناسبة لتشخيص التهابات فيروس ليسا. تبدأ الطريقة مع الحمض النووي الريبي المستخرج من داء الكلب المشتبه به قبل الوفاة أو عينات ما بعد الوفاة، بالتفصيل إعداد المزيج الرئيسي، إضافة RNA، وإعداد الجهاز في الوقت الحقيقي والتفسير الصحيح للنتائج.

Pan-lyssavirus في الوقت الحقيقي RT-PCR لتشخيص داء الكلب

نقدم بروتوكولًا كاملًا لتشخيص داء الكلب الحيواني بعد الوفاة في ظل الظروف الميدانية باستخدام اختبار تشخيصي مناعي سريع (RIDT) ، من أخذ عينات من خزعة الدماغ إلى التفسير النهائي. كما أننا نُصف التطبيقات الأخرى التي تستخدم الجهاز للتحليل الجزيئي وgenotyping الفيروسي.

حقل ما بعد الوفاة داء الكلب اختبار تشخيصية مناعية سريعة لإعدادات الموارد المحدودة مع مزيد من التطبيقات الجزيئية

يوضح هذا البروتوكول مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الفعلي (RT-PCR) لفيروس lysssavirus LN34 من جمع الأنسجة إلى تفسير النتائج ، بما في ذلك تحديثات التسلسلات والتركيبات الأولية لتحسين أداء الفحص لبعض فيروسات ليسا واللاجومورف غير داء. نوضح أيضا إعداد الفحص لتنسيق LN34 متعدد الإرسال أحادي البئر (LN34M).

تشخيص داء بعد الوفاة في عن طريق مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الحقيقي LN34 المحدث والمضاعف

تم تطوير نهج لتحديد ظروف التركيز الفيروسي المثلى لعينات المياه ذات الحجم الصغير باستخدام طفرات من الفيروس الغدي البشري. تستخدم التقنيات الموضحة هنا لتحديد معلمات التركيز للأهداف الفيروسية الأخرى ، ويتم تطبيقها على تجارب تركيز الفيروس على نطاق واسع.

إجراء بأحجام صغيرة للتركيز الفيروسي من المياه

مطلوب عناية خاصة باستخدام "التقنيات النظيفة" لجمع عينات المياه ومعالجتها بشكل صحيح لدراسات المعادن النزرة في البيئات المائية. يتم تقديم بروتوكول لأخذ العينات والمعالجة والإجراءات التحليلية بهدف الحصول على بيانات ونتائج مراقبة بيئية موثوقة بحساسية عالية للدراسات التفصيلية للمعادن النادرة.

نظيفة أخذ العينات وتحليل نهر ومصبات الأنهار المياه للدراسات المعدنية تتبع

العوالق والجسيمات المعلقة تلعب دوراً رئيسيا في الدورات البيوجيوكيميائيه في المحيط. هنا، نحن نقدم طريقة نظيفة جداً، وانخفاض ضغط لجمع مختلف أحجام الجسيمات والعوالق في البحار مع القدرة على التعامل مع كميات كبيرة من مياه البحر.

جهاز متعدد الطبقات نظيفة جداً لجمع العوالق البحرية الحجم مجزأ والجسيمات المعلقة

نقدم بروتوكولا لتركيب السكريات C5 (إكسيلوسي وارابينوز) من متجددة غير الصالحة للأكل الليجنوسليولوزيه الكتلة الحيوية (أي، الجوت) مع وجود برونستد حمضية السوائل الأيونية (كفالات) المحفز في المياه. محفز كفالات معارضها حافز أداء أفضل من المواد الحفازة الأحماض المعدنية التقليدية (ح2هكذا4 و HCl).

طريقة جديدة لتحليل بينتوسان الموجودة في الكتلة الأحيائية الجوت وتحويلها إلى أحادية السكر باستخدام السوائل الأيونية الحمضية

تعلم إجراءات مراقبة فيروس ليسا في الخفافيش بتايوان باستخدام اختبارات الأجسام المضادة الفلورية والتحليل الجزيئي. يوفر هذا البروتوكول دليلاً موحدًا للباحثين لدراسة الأمراض الحيوانية المنشأ.

إجراءات التشغيل الموحدة لمراقبة فيروس ليسا لسكان الخفافيش في تايوان

استكشف المزيد من الفيديوهات