إجراءات التشغيل الموحدة لمراقبة فيروس ليسا لسكان الخفافيش في تايوان

ليسافيروس هو مسببات الأمراض حديقة الحيوان لا تيك. لتقييم وجود فيروس ليسا في مجموعات الخفافيش التايوانية ، بدأنا برنامج مراقبة. ونجحت في تحديد أربعة فيروسات ليسا في 2016 إلى 2018.

هذا البروتوكول هو مقدمة خطوة بخطوة لمراقبة فيروس vi-al Lyssa في تايوان. نأمل أن يكون من المفيد للبحوث المهتمة في vi-al Lyssavirus الترصد. من المهم توصيل رمز tac-keg الصحيح.

الخفافيش الميتة أو المحتضرة هي أكثر ملاءمة من الخفافيش الحية لمراقبة فيروس ليسا. اعتمادا على أنظمة السلامة البيولوجية للبلد الذي يوجد فيه المختبر؛ تنفيذ الإجراءات التالية في مختبر مناسب على مستوى السلامة البيولوجية. والتأكد من أن الباحثين مؤهلون حالياً وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.

عند جمع الخفافيش أو الذبائح الضعيفة أو المريضة ، يكون لديك عالم بيئة الخفافيش تحديد أنواع الخفافيش من خلال الخصائص المورفولوجية للعينة. تقديم ورقة معلومات إلى المختبر، بما في ذلك موقع التجميع والأنواع والعلامات السريرية وغيرها من البيانات ذات الصلة مع كل عينة من الخفافيش. قبل البدء في النيروسكوبي ، قم بفحص جميع الفوهات الخارجية وتصوير الخفافيش الميزات الخارجية ، وخاصة الرأس والأذنين والأجنحة لتمايز الأنواع.

لجمع عينة مسحة عن طريق الفم وضع الخفافيش في إعادة شغل البطن على لوحة تشريح عقيمة وإصلاح الرأس مع ملاقط. استخدام مشرط لقطع الجلد على طول خط الوسط من منطقة العجل؛ وسحب الجلد إلى الجانبين الجانبي، لجعل شق في الجمجمة على طول خط الوسط من منطقة العجل. افتح الجمجمة بملاقاة لكشف أنسجة المخ واستخدم الملاقط لفصل أنسجة الدماغ عن النسيج العصبي المتصل برفق.

قطع المقطع المقطع من الدماغ، بما في ذلك جذع الدماغ والمخيخ، ولمس طفيفة السطح قطع من أنسجة الدماغ مع الشرائح الزجاجية لجعل الانطباعات تشويه. اضغط على الشريحة على أنسجة العدسة لإزالة الأنسجة الزائدة وإصلاح الشرائح الانطباع مسحة في الأسيتون درجة مئوية ناقص 20 لمدة 30 دقيقة. ثم إصلاح قطعة صغيرة من أنسجة الدماغ الطازجة، في formalin، لفحص الأمراض الهدولوجية.

ووضع بقية الأنسجة في emi-em 10 لاستخراج الحمض النووي. بعد ذلك، قم بتشريح الجلد من المتشعب إلى فتحة الشرج على طول خط الوسط في الجسم، واستخدم الملاقط لرفع وفصل الجلد وتسلط أنسجة العضلات؛للسماح بجمع الغدد اللعابية، الموجودة بالقرب من عظم المناديل. رفع قليلا القص مع ملاقط، واستخدام مشرط لقطع القص وجدار البطن على طول خط الوسط وقطع الترقوة.

استخدام الإبر لإصلاح الأقفاص الصدرية اليمنى والأيسر إلى لوحة التشريح، لفتح تجويف الصدر. وسجل الجحافل الإجمالية ودرجة تغيير ما بعد الوفاة. ثم استخدم الملاقط والمشرط لإزالة الأنسجة الحشوية حسب الاقتضاء لتحليل المصب المخطط له.

لإجراء اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة في نهاية التثبيت، قم بتجفيف شرائح الانطباع المسحة وحدد جسمين مضادين مضادين لداء الكلب الفلوري على الأقل للتحليل. قم بتميّز جسم مضاد واحد على كل شريحة من خلال مصفّر 0.45 ميكرومتر. واحتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

في نهاية الحضانة، استنزاف قبالة اقتران الزائدة وغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني. ثم استخدام حجم صغير من 10٪ الجلسرين لتركيب تغطية زلات على الشرائح وصورة الشرائح عن طريق المجهر الفلوريسنس. عندما يشير إما اختبار الأجسام المضادة الفلورية أو تحليل RT-PCR إلى الإيجابية، فإن التجانس بين عينة الدماغ في التعليق بنسبة 10٪في emi-en 10 ورواسب الأنسجة fleu-rry بواسطة الطرد المركزي.

تلقيح 200 ميكرولترات من سوبر نات أون مع ثلاث مرات 10 لخلايا الورم الأرومي العصبي 6 الماوس ومليلتر واحد من emi-en 10 لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 1٪ ثاني أكسيد الكربون. ونقل تعليق خلايا الدماغ المتجانسة إلى قارورة مربعة 25 سنتيمترًا ، تحتوي على ستة ملليلترات من emi-en الطازجة 10. في ملليلتر واحد من تعليق خلايا الدماغ المتجانسة في شريحة زجاجية مغلفة بأربعة بلبيرات ، بقطر ستة ملليمترات ووضع الشريحة عند 37 درجة مئوية و 1٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.

بعد التثبيت مع 100٪ الأسيتون، وصمة عار الشرائح مع نفس اثنين من الفلوريسنس مترافق الأجسام المضادة المضادة لداء الكلب كما تستخدم لاختبار الأجسام المضادة fluorescence. وتصور الشرائح بواسطة المجهر الفلورسنت لتحديد عدد من إدراجات intracida-plas-mic. بعد التربسينينغ وتربية الخلايا المستلقة و زراعة فرعية وفقا للبروتوكولات القياسية، والعودة إلى ثقافة الباردة حاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام أخرى مع تكرار العد من عدد الخلايا المصابة كما أظهرت فقط حتى يتم التوصل إلى 100٪ العدوى.

وفي الفترة من كانون الثاني/يناير 2014 إلى أيار/مايو 2017، تم جمع 332 جثة من الخفافيش من 13 نوعاً من أجل المراقبة. في هذا التحليل التمثيلي لحالتين إيجابيتين من الخفافيش، تم اختبار انطباع الدماغ سلبيًا باستخدام اختبار الأجسام المضادة الفلورية مع أحد الأجسام المضادة المضادة المضادة لداء الكلب، ذات النوبة، في حين أن RT-PCR الذي يستخدم كل من المجموعتين التمهيديتين المختلفتين، أسفر عن نتائج إيجابية. وكشف إخضاع تسلسل ampli-con الذي تم الحصول عليه للاستعلام عن الانفجار في قاعدة بيانات بنك Gen أن التسلسل كان مشابهًا لفيروسات ليسيسا مع هويات أقل من 79٪ تدعم هويات فيروسات ليسا المكتشفة.

تم عزل اثنين من الفيروسات Lyssa في وقت لاحق بنجاح من اثنين من العقول كما أكد اختبار الأجسام المضادة fluorescence وتسلسل. الخطوة الرئيسية لتحديد الإيجابية فيروس ليسا هي اختبار الأجسام المضادة fluorescence وتحليل RT-CPR. ينصح بشدة استخدام اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة لداء الكلب في مجموعات التمهيدي.

بالإضافة إلى فيروس Lyssa أخرى حديقة الحيوان غير- الأمراض الخفافيش-ical يمكن رصدها باستخدام طرق التشخيص مغلقة. ويمكن بعد ذلك استخدام البيانات لإعلام الجمهور حول تجنب الاتصال مع الخفافيش. كلما تمكنا من دراسة فيروس الخفافيش ، كلما تمكنا من فهم تطوره وتأثيره على الصحة العامة.