Name: نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: تعلم تقييم الاستجابات المناعية في نبات Arabidopsis thaliana باستخدام اختباري الانفجار التأكسدي العابر وتثبيط نمو الشتلات. توفر هذه الطرق تقييمات سريعة وموثوقة للمقارنة بين الأنماط الوراثية المختلفة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يتم تمويل العمل في مختبرنا من خلال برنامج اكتشاف مجلس الموارد الطبيعية والبحوث الهندسية الكندية (NSERC)، والصندوق الكندي للابتكار جون ر. إيفانز زعيم، وجامعة الملكة. يتم دعم KS وIS من خلال منح دراسية للخريجين في أونتاريو جنبا إلى جنب والمنح الدراسية للخريجين في كندا NSERC لطلاب الماجستير (CGS-M).

1. الكشف عن انفجار ROS في أقراص أوراق أرابيدوبسي بعد استثارة المناعة
<ol><li>نمو المصنع وصيانته.<ol>
<li>لمزامنة الإنبات، يتم تقسيم بذور أرابيدوبوبس إلى الدرجة المتوسطة عن طريق تعليق حوالي 50 بذور في 1 مل من أجار معقم بنسبة 0.1% [ث/v] وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية (بدون ضوء) لمدة 3-4 أيام. ملاحظة: تقسيم عنصر تحكم خلفية نوع البرية (على سبيل المثال، Col-0) والأنماط الجينية مع نواتج المناعة العالية والمنخفضة (على سبيل المثال، cpk28-1 وbak1-5 على التوالي) لتكون بمثابة عناصر تحكم داخلية.</li>
		<li>زرع البذور على التربة وتنبت في ظل الظروف القياسية قصيرة اليوم (22 درجة مئوية، 10 ساعة ضوء، 150 ملي / م2/ ق كثافة الضوء، والرطوبة النسبية 65-70٪).</li>
		<li>بعد حوالي 7 أيام، استخدم ملقط لزرع الشتلات الفردية إلى الأواني الجديدة، مفصولة بما لا يقل عن 4 سم للسماح بتطوير روزيت كامل. زرع 6-12 شتلات لكل نوع جيني والعودة إلى الظروف القياسية لوقت قصير. المياه بانتظام وتخصيب النباتات (1 غرام / لتر من 20-20-20 الأسمدة كل أسبوعين).</li>
	</ol></li>
	<li>جمع أقراص ورقة في لوحات 96 جيدا لاسترداد بين عشية وضحاها.<ol>
<li>في 4-5 أسابيع بعد الإنبات (الشكل1A)،استخدم لكمة خزعة حادة 4 مم لإزالة قرص ورقة واحدة لكل مصنع، وتجنب منتصف الوريد والحرص على الحد من الجرح (الشكل1B). ضع أقراص الأوراق في لوحة غير مستخدمة بمقياس الإنارة 96 بئراً تحتوي على 100 درجة مئوية من ddH2O مع الجانب adaxial التي تواجه صعوداً لمنع الجفاف22 (الشكل1C). إذا تم تقييم الإثارة المتعددة، قم بإزالة قرص ورقة واحدة من نفس الورقة لكل علاج. ملاحظة: أوراق العينة التي تم توسيعها بشكل كامل، من الثالث إلى الخامس من أعلى الوردة، وتقريبانفس الحجم والعمر للحد من التباين. إذا كان ذلك ممكنا، وقطع أقراص ورقة في النصف باستخدام شفرة الحلاقة قبل الانتعاش بين عشية وضحاها، وهذا يزيد من المساحة السطحية تتعرض للحل الإثارة23.</li>
		<li>استرداد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لمنع تداخل ROS التي تنتجها الجرح أثناء جمع القرص ورقة. تغطية لوحات مع غطاء لمنع التبخر.</li>
	</ol></li>
	<li>إجراء العلاج المنتقد وقياس إنتاج ROS.<ol>
<li>برنامج قارئ لوحة قبل إضافة حل رد الفعل، وهذا سوف يقلل من الوقت بين بدء انفجار ROS والقياسات الأولى المسجلة. استخدام برنامج تجاري مناسب لقارئ اللوحة. في حالتنا (راجع جدول المحتويات)،انقر فوق إعدادات، وحدد خرطوشة LUM96 ونوع القراءة الحركية. انقر فوق الفئة ناحية القراءة واسحب لتحديد مجموعة فرعية من الآبار أو اللوحة بأكملها المراد قراءتها. ضمن علامة التبويب PMT والبصريات، قم بتعيين وقت التكامل إلى 1000 مللي ثانية ضمن علامة التبويب التوقيت، قم بتعيين إجمالي وقت التشغيل إلى 40-60 دقيقة والفاصل الزمني إلى 2 دقيقة.</li>
		<li>إزالة الماء من كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. ملاحظة: لا ثقب أقراص ورقة، لأن هذا قد يسبب الإجهاد الجرح ويؤدي إلى المزيد من المخرجات ROS متغير.</li>
		<li>إعداد حل رد فعل يحتوي على 100 ميكرومتر لومينول، 10 ميكروغرام / مل HRP، والتركيز المطلوب من الإثارة (على سبيل المثال: elf18 في 1 nM، 10 nM، 100 nM، أو 1000 nM) في ddH2O معقمة باستخدام 10 مل من الحل للوحة واحدة 96 جيدا. ملاحظة: حل الببتيدات اللوفيلية في H2O المعقمة في أنابيب منخفضة الربط لجعل مخزون 10 mM، فلاش تجميد في السائل N2،وتخزينها في -80 درجة مئوية. عندما تكون جاهزة للاستخدام، تمييع الأسهم في H2O المعقمة لتوليد مخزون عامل 100 درجة مئوية وتخزينها عند -20 درجة مئوية.</li>
		<li>استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 100 ميكرولتر من خليط التفاعل لكل بئر، إضافة إلى الحل لجميع أقراص ورقة من نفس المعاملة في نفس الوقت22. تضمين رد فعل التحكم (لا مُستثير) لكل نمط جيني لتقييم مستويات ROS القاعدية في غياب الإثارة. قياس الانبعاثات الخفيفة على الفور لجميع الأطوال الموجية في الطيف المرئي باستخدام قارئ لوحة صغيرة. ملاحظة: إعداد وتطبيق حل رد الفعل تحت ضوء منخفض، كما luminol وHRP هي الكواشف الحساسة للضوء. احتفظ بالكواشف على الجليد أو عند -20 درجة مئوية ما لم تكن في الاستخدام.</li>
		<li>قياس انبعاث الضوء مع 1000 مللي ثانية وقت التكامل في فترات 2 دقيقة على مدى فترة 40-60 دقيقة في قارئ لوحة صغيرة من أجل التقاط انفجار الأكسدة الديناميكية (الشكل1D). ملاحظة: استخدم وقت تكامل أطول لتحسين حساسية الفحص11، مع التأكد من أن جميع العينات في لوحة 96 بئر يمكن قياسها ضمن فاصل زمني واحد.</li>
	</ol></li>
	<li>تفسير البيانات.<ol>
<li>لكل نمط جيني، استخدم تطبيق جدول بيانات لحساب متوسط عدد الفوتون والخطأ القياسي في كل نقطة زمنية، وعرض إنتاج ROS كدالة وقت باستخدام رسم مبعثر. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq1.jpg"> حيث t = كل نقطة زمنية
</li>
		<li>بدلاً من ذلك، قم بتصنيف الفوتون لكل قرص ورقة وعرض متوسط هذه القيم لكل نمط جيني باستخدام رسم بياني شريطي مع أشرطة خطأ قياسية أو مربع وقطعة خفق. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq2.jpg">
</li>
	</ol></li>
</ol>2. تسرب النمو تسرب
<ol><li>تعقيم البذور وزرع على لوحات Murashige وSkoog (MS).<ol>
<li>إعداد نصف قوة معقمة (0.5x) MS المتوسطة (2.16 غرام / لتر) تحتوي على 0.8٪ أجار [ث / v]. صب وسائل الإعلام في لوحات (90 × 15 ملم) في غطاء محرك السيارة تدفق laminar.</li>
		<li>تعقيم ما يقرب من 100 البذور في أنبوب microcentrifuge عن طريق الغسيل مع 1 مل من الإيثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة وإزالة عن طريق الطموح. يُضاف 1 مل من التبييض بنسبة 40% والصخور برفق لمدة 17 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة التبييض عن طريق الطموح وغسل ثلاث مرات في 1 مل من الماء المعقم لمدة 5 دقائق. ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم بروتوكول تعقيم بذور غاز الكلور24.</li>
		<li>زرع ما يقرب من 100 بذور لكل النمط الجيني على لوحات أجار MS باستخدام ماصة وختم مع شريط micropore في غطاء محرك السيارة تدفق laminar. ملاحظة: تجنب وضع البذور على مقربة من ذلك لأن هذا سيجعل زرع الشتلات صعبة في وقت لاحق.</li>
		<li>تصنيف البذور عن طريق وضع لوحات في 4 درجة مئوية (لا ضوء) لمدة 3-4 أيام لمزامنة الإنبات (الشكل2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>زرع الشتلات في لوحات 48 جيدا تحتوي على الببتيدات المناعية.<ol>
<li>بعد التقسيم الطبقي، نقل لوحات إلى الضوء في ظل ظروف قصيرة اليوم (22 درجة مئوية، 10 ساعة ضوء، 150 ملي / م2/ ق كثافة الضوء، و 65-70٪ الرطوبة النسبية) لمدة 3-4 أيام للسماح الإنبات.</li>
		<li>في غطاء محرك السيارة تدفق laminar، وإعداد تخفيف الببتيد المنضفي (0 nM، 1 nM، 10 nM، 100 nM، و 1000 nM) في وسائل الإعلام السائلة 0.5x MS المعقمة التي تحتوي على 1٪ السكروز [ث / الخامس]، وذلك باستخدام 25 مل من MS لكل لوحة 48 جيدا. إعداد لوحات عن طريق الأنابيب 500 درجة مئوية من MS السائل المتوسطة أو MS المتوسطة التي تحتوي على الببتيدات في بئر. إذا كان متوفراً، استخدم جهاز تكرار لإعداد اللوحة لتسريع العملية. ملاحظة: لكل النمط الجيني، تنمو الشتلات في مرض التصلب العصبي المتعدد دون مُستثير لحساب أي اختلافات متأصلة في نمو الشتلات.</li>
		<li>باستخدام ملقط معقمة زرع بعناية شتلة واحدة إلى كل بئر من نفس الحجم والعمر، وضمان عدم وجود ضرر للشتلات أو الكسر إلى الجذر وأن يتم غمر الجذر في وسائل الإعلام. لكل نمط جيني، زرع ما لا يقل عن 6-8 شتلات في كل تخفيف الببتيد (الشكل2B). ملاحظة: الشتلات زرع في 4 أيام بعد الإنبات، والجذور القصيرة هي أسهل للتلاعب، والشتلات القديمة قد تسفر عن نتائج أقل الأمثل.</li>
		<li>ختم لوحات مع شريط micropore والعودة إلى الضوء في ظل ظروف اليوم القصير القياسية (22 درجة مئوية، 10 ساعة ضوء، 150 م/ م2/ ق كثافة الضوء، والرطوبة النسبية 65-70٪). السماح للشتلات أن تنمو لمدة 8-12 يوما.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحديد تثبيط النمو في المئة.<ol>
<li>إزالة الشتلات بعناية من لوحات 48 جيدا وتجف عن طريق التخميد على منشفة ورقية. وزن الشتلات على مقياس تحليلي وقيم قياسية. إذا كان متوفرًا، استخدم مقياسًا تحليليًا مجهزًا بخرج USB لتسجيل قيم وزن جديدة في جدول بيانات. قبل وزن الشتلات، التقاط صورة لعرض بصريا تثبيط النمو (الشكل2C).</li>
		<li>تحديد نسبة تثبيط النمو من الشتلات المعالجة بـ elicitor مقارنة بالشتلات المزروعة في مرض التصلب العصبي المتعدد فقط (الشكل2D)على النحو التالي: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq3.jpg">
</li>
		<li>رسم البيانات باستخدام رسم بياني شريطي مع أشرطة الخطأ القياسية أو استخدام مربع ومؤامرة شعيرات لعرض أفضل التباين بين التجريبية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

تصف هذه الورقة طريقتين لـ "الاستجابات المناعية التي يتم تشغيلها بالنمط" في "أرابيدوبسي"،وتقدم نُهجاً كمية لتقييم الناتج المناعي دون استخدام معدات متخصصة. في تركيبة، يمكن استخدام ROS وSGI التي يتم تشغيلها نمط لتقييم الاستجابات المبكرة والمتأخرة لتصور الميكروبات، على التوالي.
الحد الرئيسي من التأكسد انفجار التبيّر هو التغير. لأسباب غير مفهومة تماماً، غالباً ما تختلف RLUs المطلقة بترتيب الحجم بين التجارب. ولأن التباين بين التجارب مرتفع، فمن المستحسن أن تشمل ضوابط مرجعية داخلية ذات مستويا...

لإدراك وحماية ضد مسببات الأمراض، تطورت النباتات مستقبلات التعرف على نمط الغشاء المرتبطة (PRRs) التي تكشف عن الجزيئات الميكروبية المحفوظة خارج الخلية المعروفة باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات (MAMPs)1. ربط MAMPs إلى PRRs cognate الخاص بهم يبدأ البروتين kinase بوساطة إشارات المناعة مما أدى إلى مقاومة الأمراض واسعة الطيف2. واحدة من الاستجابات الأولى بعد تفعيل PRR هو الفوسفور وتنشيط غشاء البلازما المتكاملة انفجار الجهاز التنفسي OXIDASE التجانس (RBOH) البروتينات التي تحفز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي خارج الخلية (ROS)3 , 4.ROS تلعب دورا هاما في إنشاء مقاومة المرض، والعمل على حد سواء كرسل الثانوية لنشر إشارات المناعة وكذلك العوامل المضادة للميكروبات المباشرة5. ووصفت الملاحظة الأولى لانفجار الأكسدة المناعة باستخدام درنات البطاطا من السيرة الذاتية. وقد تم تقييم إنتاج ROS في العديد من الأنواع النباتية باستخدام أقراص ورقة7، والخلايا تعليق الثقافات8، وprotoplasts6. وصف هنا هو طريقة بسيطة لـ "إنتاج روس" الذي يُشغّل بالنمط في أقراص أوراق من أرابيدوبس ثاليانا (أرابيدوبسي).
استجابة لتصور MAMP، والبروتينات RBOH المنشطة تحفز إنتاج الجذور superoxide (O2-)، جذور الهيدروكسيل (•OH)، والأكسجين singlet (1 O2)التي يتم تحويلها إلى بيروكسيد الهيدروجين (H2O 2)في الفضاء خارج الخلية9. H2O2 يمكن قياسها كميا ً بواسطة اللوميلومينسين القائم على الإنارة في وجود البيروكسيداز الفجل عامل المؤكسدة (HRP)10. HRP أكسدة H2O2 توليد أيون هيدروكسيد (OH-) وغاز الأكسجين (O2)التي تتفاعل مع luminol لإنتاج وسيطة غير مستقرة التي تطلق فوتون من الضوء10. ويمكن قياس انبعاث الفوتون كمياً كوحدات ضوئية نسبية (RLUs) باستخدام قارئ لوحة صغيرة أو صور قادرة على الكشف عن الإنارة، التي أصبحت قطعاً قياسية من المعدات في معظم المختبرات الجزيئية. من خلال قياس الضوء الناتج على مدى فترة 40-60 دقيقة، يمكن الكشف عن انفجار الأكسدة عابرة في وقت مبكر 2-5 دقائق بعد العلاج المنتقد، وبلغت ذروتها في 10-20 دقيقة، والعودة إلى مستويات القاعدية بعد ~ 60 دقيقة11. يمكن استخدام الضوء التراكمي المنتج على مدى هذا الوقت بالطبع كمقياس للقوة المناعية المقابلة لتنشيط البروتينات RBOH12. مريح، هذا الاختبار لا يتطلب معدات متخصصة أو إعداد عينة مرهقة.
بلغت ذروتها بعد وقت قصير من الكشف MAMP، ويعتبر انفجار الأكسدةاستجابة المناعة في وقت مبكر، جنبا إلى جنب مع تفعيل MAPK وإنتاج الإيثيلين 5. وتشمل الاستجابات المناعية في وقت لاحق إعادة برمجة النسخ، وإغلاق stomatal، وترسب الكالوز2،5. التعرض لفترات طويلة لMAMPs ينشط باستمرار إشارات المناعة بنشاط مكلفة مما أدى إلى تثبيط نمو النبات، مما يدل على المفاضلة بين التنمية والحصانة13. يستخدم على نطاق واسع تثبيط نمو الشتلات التي تسببها نمط (SGI) لتقييم الناتج المناعي في Arabidopsis وكان جزءا لا يتجزأ من تحديد العديد من المكونات الرئيسية للإشارات المناعية بما في ذلك PRRs14،15 ،16. لذلك، تقدم هذه الورقة بالإضافة إلى ذلك بحثاً عن SGI التي يتم تشغيلها على النمط في أرابيدوبسي،حيث يتم زراعة الشتلات في لوحات متعددة الآبار تحتوي على وسائل إعلام قياسية أو وسائل إعلام مُستكملة بمُرّخ مناعي لمدة 8-12 يومًا ثم تزن باستخدام مقياس تحليلي.
ولبيان كيفية استخدام اختباري ROS وSGI لرصد الإشارات التي يتم التوسط فيها بوساطة PRR، تم اختيار ثلاثة أنماط جينية تمثل نواتج مناعية مختلفة: (1) انضمام نوع عربيدوبسي البري كولومبيا (Col-0)، (2) bak1-5 السلبي المهيمن متحولة فيها متعددة الوظائف PRR المشارك مستقبلات BRASSINOSTEROID غير حساسة 1-المرتبطة KINASE 1 (BAK1) غير وظيفية في إشارات المناعة17،18،و (3) cpk28-1 متحولة متنحية، والتي تفتقر إلى البروتين التنظيمي الذي يعتمد على الكالسيوم KINASE 28 (CPK28) ويعرض الاستجابات المناعية المرتفعة19،20. يتم تقديم الاختبارات ROS وSGI استجابة لepitope الببتيد elf18 المنتجة صناعيا من عامل استطالة البكتيرية تو (EF-Tu)، المعترف بها في Arabidopsis من قبل مستقبلات EF-Tu PRR (EFR)15. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات مع المحفزات المناعية الأخرى مثل بروتين الحركة البكتيرية فلانيلين14 أو البروتينات النباتية الذاتية (AtPeps)16، ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن استجابة النبات تختلف اعتمادا على 21. ويمكن استخدام الاختبارات التي أجرتها ROS وSGI معاً من أجل التقييم السريع والكمي للاستجابات المبكرة والمتأخرة التي يتم الاستجابة بوساطة PRR.

<table><tbody><tr><td>20-20-20 مصنع الأسمدة</td><td>Prod</td><td>10529</td><td>امزج 1 جم / لتر في الماء وضعه على النباتات كل أسبوعين للحصول على النمو الأمثل.</td></tr>يمكن <tr><td>أيضا استخدام مجموعة حفار الفلين بمساحة 0.125 سم ^</td> 2 مم من Biopsy <td>Punch</td><td>Medical Mart 232-33-34-P</td>.<td></td></tr><tr><td>48 بئر ألواح معقمة مع غطاء</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>مقياس تحليلي مع مسودة Sheid</td><td>VWR</td><td>VWR-225AC</td><td>يمكن استخدام أي مقياس تحليلي قياسي لمقايسات بدء النمو ، ومع ذلك ، فإن إخراج الكمبيوتر المباشر هو الأمثل.</td></tr><tr><td>BioHit mLine Mechanical 12 ماصة متعددة القنوات (30-300 دولة)</td><td>Sartorius</td><td>725240</td><td>يمكن استخدام أي ماصة متعددة القنوات، وكذلك ماصة واحدة إذا لزم الأمر.</td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ</td> <td>Biolab</td><td>cp7211</td><td>قم بتخزين 10 ملي مولار من الببتيد عند -80 درجة مئوية في أنابيب ربط منخفضة البروتين. عند الذوبان ، قم بتخزين 100 ميكرومتر من المخزون العامل عند -20 درجة مئوية.</td></tr><tr><td>ملقط</td><td>فيشر Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>الفجل بيروكسيداز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P6782</td><td>يذوب في الماء النقي. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية وبعيدا عن الضوء.</td></tr>يذوب <tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>في DMSO. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية وبعيدا عن الضوء.</td></tr><tr><td>Murisage و Skoog Basal Salts</td><td>Cedarlane Labs</td><td>MSP09-100LT</td><td>Store عند 4 درجة مئوية.</td></tr><tr>مزيج الشمس <td>المشرقة للبستنة</td> <td>من التربة</td><td># 1</td><td>يمكن أيضا استخدام أنواع التربة الأخرى لزراعة نبات الأرابيدوبسيس. تخلط بالماء عند ملء الأواني.</td></tr>يجب <tr><td>أن يطلب SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader مع الأجهزة</td><td>الجزيئية</td> لوحدة LUM <td>اقتباس</td> يمكن <td>استخدام أي قارئ لوحة قادر على اكتشاف اللمعان لهذه الفحوصات.</td></tr><tr><td>السكروز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S0389-1KG</td><td>يحفظ في درجة حرارة الغرفة.</td></tr><tr><td>ألواح البوليسترين الأبيض 96 بئر</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>07-200-589</td><td></td></tr></tbody></table>

نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

وقد تطورت النباتات نظام المناعة قوية لإدراك مسببات الأمراض والحماية من المرض. تصف هذه الورقة اختبارين يمكن استخدامهما لقياس قوة التنشيط المناعي في أرابيدوبسي ثاليانا بعد العلاج بجزيئات الإثارة. المقدمة أولاً هي طريقة لالتقاط الاندفاع التأكسدي السريع والديناميكي، والتي يمكن رصدها باستخدام الفحص القائم على الإنارة. الثاني هو طريقة تصف كيفية قياس تثبيط المناعة الناجمة عن نمو الشتلات. هذه البروتوكولات سريعة وموثوق بها، لا تتطلب التدريب المتخصص أو المعدات، وتستخدم على نطاق واسع لفهم الأساس الوراثي للمناعة النباتية.

متحولة cpk28-119،25 وbak1-517،تم استخدام18 النباتات لإظهار النتائج المتوقعة للأنماط الجينية مع استجابات المناعة العالية والمنخفضة، على التوالي، في انفجار الأكسدة وSGI الاختبارات نسبة إلى عنصر تحكم خلفية من النوع البري (Col-0). لتقييم الآثار التي تعتمد على الجرعة، تم استخدام سلسلة تخفيف الببتيد 10 أضعاف (1-1000 nM) من elf18. وكما هو متوقع، فإن خطوط فقدان ا...

تصف هذه الورقة طريقتين لتحديد الاستجابات الدفاعية في أرابيدوبسي ثاليانا بعد التعرض للمناضد المناعية: انفجار الأكسدة العابرة، وتثبيط نمو الشتلات.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

يمكن استخدام هذه المقايسات لتقييم ومقارنة النواتج المناعية للنمط الجيني النباتي المختلف. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها سريعة وموثوقة، واستخدام معدات المختبرات المشتركة. بالنسبة لمقايسة تثبيط النمو ، يجب زرع الشتلات من نفس الحجم والعمر وتجفيفها بالكامل قبل وزنها للحد من الاختلاف.في أربعة إلى خمسة أسابيع بعد الإنبات، واستخدام لكمة خزعة حادة من أربعة ملليمتر لإزالة قرص ورقة واحدة لكل نبات Arabidopsis، وتجنب midvein والحرص على الحد من الجرح. جمع الأقراص في آبار فردية من لوحة مضيئة 96-well غير المستخدمة التي تحتوي على 100 ميكرولترات من المياه المقطرة المزدوجة في البئر، الجانب adaxial حتى، لمنع desiccation. إذا تقييم المحفزات متعددة، وإزالة قرص ورقة ثانية من نفس الورقة لكل علاج الإثارة، وتغطية لوحة مع غطاء للسماح لأقراص ورقة لاسترداد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.في صباح اليوم التالي، تعيين المعلمات القارئ microplate إلى 1، 000 ميلي ثانية وقت التكامل في فترات لمدة دقيقتين على مدى فترة 40 إلى 60 دقيقة لالتقاط انفجار الأكسدة الديناميكية. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لاستبدال المياه في كل بئر بـ 100 ميكرولترات من محلول التفاعل الطازج، بما في ذلك التحكم، ولا تفاعل مُثير لكل نوع جيني لتقييم مستويات أنواع الأكسجين رد الفعل القاعدي في غياب الإثارة. ثم، وقياس فورا انبعاث الضوء لجميع الأطوال الموجية في الطيف المرئي على قارئ microplate.في أربعة أيام بعد الإنبات، تحميل كل بئر من لوحة 48-جيدا مع 500 ميكرولترات من المتوسط MS تستكمل مع تخفيف الببتيد ينزبيب. بعد ذلك ، استخدم ملقطًا معقمة لزرع 6 إلى 8 شتلات من نفس الحجم والعمر والنمط الجيني لكل تخفيف الببتيد ، مع الحرص على عدم وجود ضرر على الشتلات أو الكسر في الجذر وأن الجذر مغمور في الوسط. عندما تم مطلي جميع الشتلات، ختم لوحات مع الشريط Micropore، ووضع النباتات في ظل ظروف قياسية لمدة يوم قصير لمدة ثمانية إلى 12 يوما.لتحديد تثبيط النمو في المئة، التقاط صورة لتسجيل بصريا تثبيط النمو قبل إزالة بعناية الشتلات من كل بئر. ثم، الداب الجذور على منشفة ورقية لتجف، وتزن كل شتلة على مقياس تحليلي. في هذه التجربة التمثيلية، أظهرت النباتات المتحولة ذات الإشارات المناعية المفرطة النشاط انفجارًا مؤكسدًا أعلى ومتوسطًا مقارنة بالنباتات العربية من النوع البري، في حين أن النباتات المتحولة ذات الإشارات المناعية الضعيفة أظهرت انفجارًا مؤكسدًا مخفضًا عند تركيزات تتراوح بين 10 و1000 نانومولر.ويمكن أيضا تمييز الاختلافات المتوقعة في تثبيط نمو الشتلات بين جميع الأنماط الجينية التي نمت في تركيزات الببتيد النانومولر 100 و 000 1 نانومولر. عندما نمت في 1000 نانومولر ببتيد تخفيف، كانت المسوخ مع إشارات المناعة مفرطة النشاط أصغر بشكل ملحوظ من النباتات من النوع البري التي تزرع في ظل نفس الظروف، في حين أن المسوخ مع ضعف إشارة المناعة عرض تثبيط ضعيف للنمو نسبة إلى النباتات من النوع البري. توفر هذه الطرق أدلة على الاستجابات المناعية المبكرة والمتأخرة.ويمكن استخدام العديد من التقنيات الأخرى، بما في ذلك مقايسات كيناز MAP، والتعبير الجيني الناجم عن مسببات الأمراض، وم مقايسات العدوى، لتحديد هذه المسارات. وقد تم تعديل هذه التقنيات لاستخدامها في الشاشات الكبيرة، التي نجحت في تحديد البروتينات مستقبلات الممرض والعديد من المكونات الأخرى إشارة.

pattern-triggered-oxidative-burst-seedling-growth-inhibition-assays

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

ووصف موت الخلايا المستندة للمقايسة الوكالة في محطات benthamiana نيكوتيانا.

مقايسة لمسببات الأمراض ، المرتبطين نمط الجزيئية (PAMP) - الحفز الحصانة (كونا) في النباتات

والسعي أساسية في بيولوجيا الخلية هو تحديد الآليات التي تكمن وراء هوية العضيات التي تجعل الخلايا حقيقية النواة. هنا نقترح طريقة لتحديد الجينات المسؤولة عن سلامة المورفولوجية والوظيفية من العضيات النباتية باستخدام المجهر مضان والأدوات التسلسل من الجيل التالي.

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس الانفجار التأكسدي في أوراق نبات الأرابيدوبسيس عند استنباط المناعة. يتم تحضين أقراص الأوراق ، المقطوعة من أوراق النبات ، بالببتيدات البكتيرية التي تعمل كأنماط جزيئية مرتبطة بالميكروبات أو MAMPs. عند اكتشاف MAMPs ، تحفز الخلايا النباتية إنتاج ROS خارج الخلية ، والذي يتم اكتشافه باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي.

اختبار للكشف عن الانفجار التأكسدي في أقراص أوراق نبات الأرابيدوبسيس عند استنباط المناعة

يوضح هذا الفيديو مقايسة تثبيط نمو الشتلات في نبات نبات ن يتم تحديد تأثير زيادة تركيز محفز الببتيد المناعي على نمو الشتلات.

قياس تثبيط نمو الشتلات الناجم عن المناعة

يعد القياس الكمي لنمو مسببات الأمراض أداة قوية لتوصيف الاستجابات المناعية المختلفة لأرابيدوبسيس ثاليانا (المشار إليها فيما يلي: نبات الأرابيدوبسيس). تقدم الطريقة الموضحة هنا مقايسة تسلل حقنة محسنة لتحديد كمية Pseudomonas syringae pv. البقعة نمو ES4326 في أوراق نبات الأعربي البالغة.

بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana-الزائفة syringae</em&gt; Pathosystem

وكان الهدف من هذه الدراسة لتحديد آثار التبييض والكلور غاز التعقيم على إنبات البذور الأنماط الجينية طائفة من نبات يزرع في وسائل الإعلام العقيمة. وقد وضعت بروتوكولات التعقيم الأمثل لمنع نمو الملوثات الميكروبية مع توفير البذور مرضية البقاء على قيد الحياة.

طريقة موحدة للتعقيم الفائق من بذور نبات

يتم توفير بروتوكول عالي الإنتاجية للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) ، وتحسين خطوات التعامل مع السائل باستخدام جهاز شفط بسيط تم بناؤه بمضخة فراغ. يمكن تعقيم مئات عينات البذور في يوم واحد.

طريقة عالية الإنتاجية وقوية ومرنة للغاية للوقت للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsis

هنا ، نصف أداة متقدمة مصممة لمراقبة التخليق الحيوي للكلوروفيل خلال المراحل المبكرة من إزالة الشتلات من أرابيدوبسيس . توفر المنهجية الجديدة تصويرا غير جراحي مضان الكلوروفيل في الوقت الفعلي بدقة مكانية وزمانية عالية.

الفحص غير الجراحي لتحديد حركية التخليق الحيوي للكلوروفيل خلال المراحل المبكرة من إزالة التخليق من أرابيدوبسيس

نقدم هنا طريقة بسيطة للمراقبة المباشرة والقياس الآلي لاستجابات الثغور للغزو البكتيري في Arabidopsis thaliana. تستفيد هذه الطريقة من جهاز تصوير الفم المحمول ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور المصمم لصور الأوراق التي يلتقطها الجهاز.

الملاحظة المباشرة والقياس الآلي لاستجابات الثغور لحقنة الزائفة الكهروضوئية. طماطم DC3000 في أرابيدوبسيس تاليانا

يصف هذا البروتوكول نهجا عالي الإنتاجية لتقييم تسرب أيونات النبات، ونشاط البيروكسيداز، وإنتاج الكالوز في نفس العينة.

تقييم استجابات الأوراق للمستقلبات الثانوية الميكروبية باستخدام تنسيق عالي الإنتاجية

تعلم تقييم الاستجابات المناعية في نبات Arabidopsis thaliana باستخدام اختباري الانفجار التأكسدي العابر وتثبيط نمو الشتلات. توفر هذه الطرق تقييمات سريعة وموثوقة للمقارنة بين الأنماط الوراثية المختلفة.

نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي

استكشف المزيد من الفيديوهات