VirWaTest، طريقة نقطة الاستخدام للكشف عن الفيروسات في عينات المياه

توجد الفيروسات المعوية في الغالب في الخزانات المائية المختلفة، بما في ذلك المياه الجوفية والمياه الثابتة والجداول والأنهار ومياه الينابيع. وهي ترتبط بالمخاطر الصحية وهي مسؤولة عن العدوى في البشر. الفيروسات المعوية عادة ما تسبب التهاب المعدة والأمعاء وتنتقل في الغالب عن طريق البراز عن طريق الفم.

وتتسبب الأمراض الأخرى المنقولة بالمياه في التهاب الكبد الحاد بفيروس التهاب الكبد A وفيروسات التهاب الكبد E، مع نسبة وفيات كبيرة مرتبطة به، خاصة فيما يتعلق بالتهاب الكبد E لدى النساء الحوامل. وقد تم تصميم البروتوكولات الفعلية لمراقبة جودة المياه المقترحة للسياقات الإنسانية للحفاظ على البكتيريا مثل كولاي كمؤشر على تلوث البراز. ولكن من المعروف بالفعل أنه لا يوجد ارتباط مع الكائنات الحية الدقيقة الأخرى مثل الفيروسات التي تكون أكثر مقاومة للعديد من عمليات التنشيط.

وحتى الآن، تم الكشف عن الفيروسات في حالات الأزمات الإنسانية عن طريق تكييف البروتوكولات القائمة مع ظروف تلك السياقات، وشحن عينات إلى المختبرات المرجعية للكشف الجزيئي عن الفيروسات. وهناك حاجة إلى أساليب للكشف عن مسببات الأمراض الفيروسية والمؤشرات الفيروسية في وجهات النظر للحد من مخاطر الصحة العامة، ومنع تفشي الأمراض وزيادة كفاءة التدخلات الإنسانية. نقترح طريقة للكشف عن الفيروسات في 10 لتر عينات المياه التي تنقسم إلى ثلاث خطوات: تركيز الفيروسية, استخراج الحمض النووي, والكشف الفيروسية.

وقد تم تكييف جميع هذه الخطوات من الأساليب المستخدمة حاليا في مختبرنا، ويمكن تنفيذها في نقطة من وجهات النظر باستخدام الكواشف والمعدات المحمولة، وإنتاج المعالين من إمدادات الطاقة والمجمدات. كما أضيف إلى الطريقة محلول حافظ لضمان ثبات الأحماض النووية للشحن إلى المختبرات المرجعية إذا لزم الأمر. وتسمى الطريقة التي نقترحها VirWaTest وقد تم تطويرها بالتعاون مع GenIUL وIntermon Oxfam.

قبل البدء، ينبغي النظر في عدد العينات التي سيتم اختبارها لإعداد الكواشف والمواد. ويوصى بجمع نسختين متماثلتين لكل عينة مياه من أجل الحصول على نتائج تمثيلية. يمكن اختبار عدة عينات في نفس الوقت إذا كان المبلغ المناسب من المواد المتاحة.

يجب إعداد الكواشف والمواد وتعبئته قبل نقلها أو شحنها إلى المكان الذي تحتاج إليه الطريقة. ويرد في الجدول الأول وصف قائمة المواد والمعدات الصغيرة التي ينبغي تعبئتها. إعداد bacteriophage MS2 الأسهم التي تضاف إلى كل عينة المياه كتحكم عملية باتباع أسلوب ISO المقابلة.

ثم توزيع 10 ميكرولترات من تعليق تحتوي على 10 إلى 10 وحدات platforming قبل صنعها في أنابيب 10 مل والسماح للماء الجاف. وسوف تكون هناك حاجة إلى أنبوب واحد لعينة المياه. بالإضافة إلى ذلك، قم بإعداد أنبوب واحد يحتوي على 10 mLs من الماء المقطر المعقم لكل عينة تم جمعها.

بالنسبة لمحلول الحليب منزوع الدسم مسبقًا ، قم بإعداد أنبوب يحتوي على الحليب منزوع الدسم ، وكيس بلاستيكي سستة يحتوي على ملح البحر ، وزجاجة بلاستيكية تحتوي على الماء المقطر. لتعديل درجة الحموضة، قم بإعداد أنبوب يحتوي على حمض الستريك، وأنبوب يحتوي على هيدروكسيد الصوديوم، وحاويات بلاستيكية 25 و50 م. لكل عينة مياه ليتم اختبارها ، قم بإعداد كيس تكييف عن طريق إضافة أملاح البحر وحمض الستريك إلى كيس بلاستيكي سستة ، ومحلول الحفاظ عن طريق إضافة العازلة ، والمواد الحافظة للحمض النووي ، إلى أنبوب 5 مل.

وأخيرا، إعداد أربعة أكياس تحييد، إضافة المنظفات السلطة إلى أربعة أكياس بلاستيكية سستة. لكل عينة مياه يتم استخراجها، قم بإعداد أنبوب واحد يحتوي على خمس ملليلتر يحتوي على جزيئات مغناطيسية وإيثانول، وثلاث أنابيب 2 مل تحتوي على 500 و600 و200 ميكرولترات من مخازن الغسيل واحد واثنين وثلاثة على التوالي، وأنبوب واحد يحتوي على عازلة للمياه. ويمكن تحليل اثنين من استخراج الحمض النووي مختلفة في وقت واحد في كل اختبار PCR إذا تم استخدام ثيرسيكول نيويل.

لجميع المقايسات PCR، وإعداد المياه البيولوجيا الجزيئية. إعداد خلطات تحتوي على 2 التمهيدية وإثبات واحد محدد لكل فيروس الهدف وفقا للأحجام والتركيزات الموصوفة في البروتوكول. لكل فيروس، إضافة وحدات التخزين المشار إليها في أنابيب واحد إلى ثمانية من علبة أنابيب.

قطع الشريط، وتقسيمه إلى شريطين. أنابيب من واحد إلى خمسة وأنابيب من ستة إلى ثمانية. لكل فيروس، والهواء الجاف تعليق الحمض النووي تحتوي على 10 إلى 5، 10 إلى 7، و 10 إلى 9 ونسخ معروفة مسبقا في أنابيب ستة وسبعة وثمانية.

ويستند هذا البروتوكول تركيز على مبدأ flocculation العضوية التي انخفاض درجة حَسّيّة الجسم وارتفاع الموصلية شرط يدفع بروتينات الحليب الخالي من الدسم لتنظيمها في flocs الفيروسات تمتص إلى. بمجرد تسوية flocs ، يمكن جمعها بسهولة. جمع عينة ماء 10 لتر في دلو مسطحة القاع المقدمة مع غطاء.

إذا جمع من أنبوب، والسماح للمياه تشغيل لبضع ثوان قبل جمع المياه. من المهم استخدام دلاء واضحة لتصور الكريات. ابحث عن مساحة مسطحة في مكان جديد بعيدًا عن ضوء الشمس المباشر ضع مُحركًا مغناطيسيًا متصلاً ببطارية تحت دعم الدلو ووضع الدلو الذي يحتوي على عينة الماء على كل دعم.

إعادة النظر في حمض الستريك وهيدروكسيد الصوديوم ويهز حتى يتم حلها تماما. صب 500 مل من الماء المقطر في كيس الوقوف المتابعة ووضع الحقيبة على مُحرك مغناطيسي. تُضاف محتويات كيس ملح البحر الواحد ومحتويات أنبوب حليب مُقلّف واحد ويُحرّك لمدة خمس دقائق بسرعة متوسطة.

ضبط درجة الحموضة من الحليب الخالي من السكّان باستخدام حمض الستريك وهيدروكسيد الصوديوم إلى درجة الحموضة بين 3.4 و 3.6. إيقاف المُحرك المغناطيسي والتأكد من أن الفلوكات مرئية. قد يساعد مصباح يدوي في تصور flocs.

إسقاط المغناطيس اثارة في الماء. تعيين الستيرير المغناطيسي في أقصى سرعة وتشغيله. أضف 10 mLs من الماء المقطر إلى أنبوب يتم التحكم فيه.

عكس ذلك عدة مرات وصب الحل في الماء. صب محتويات عينة واحدة تكييف كيس في الماء ويحرك لمدة خمس دقائق. تأكد من درجة الـ PH لعينة الماء، والتي يجب أن تكون بين 3.4 و 3.6.

ضبط درجة الـ PH إذا لزم الأمر. إضافة 100 mLs من محلول الحليب الخالي من الدسم قبل flocculated، وختم دلو مع الغطاء وترك الماء اثارة لمدة ثماني ساعات في الحد الأدنى من السرعة. بعد ثماني ساعات، إيقاف المحرك المغناطيسي والسماح flocs لتسوية لمدة خمس ساعات إضافية على الأقل.

مع نظام يقوم على استخدام وحدة تحكم ماصة، أنبوب من البلاستيك، واثنين من الماصات، والتخلص من المصات، مع الحرص على عدم إزعاج flocs على أسفل دلو. عندما يكون مستوى الماء على وشك الوصول إلى المغناطيس التحريك، والضغط على أنبوب من البلاستيك لوقف تدفق المياه والابتعاد عن الماصات من دلو. يهز دلو لإعادة تعليق flocs وصبها في كيس من البلاستيك الوقوف المتابعة.

السماح لflocs لتسوية لمدة ساعة إضافية واحدة. pirate بعناية عظمى المياه باستخدام ماصة تجنب لإزعاج flocs. التعرق flocs باستخدام ماصة ونقلها إلى أنبوب مخروطي.

لاحظ أسفل الحجم النهائي من العينة التركيز ونقل 1 مل إلى أنبوب يحتوي على محلول حافظ. ويمكن استخدام التعليق إما لإجراء استخراج الحمض النووي في الحقل، أو الشحن إلى مختبر مرجعي لمزيد من التحليل. يجب معالجة المياه التي يتم التخلص منها أثناء جمع النفايات قبل التخلص منها.

إضافة محتويات كيس وكيل تحييد إلى دلو يحتوي على المياه المهملة. اخلطي الماء واتركيه لمدة ثلاثين دقيقة. ثم تخلص من المياه المعالجة كنفايات عامة.

يمكن نقل الجسيمات المغناطيسية من أنبوب إلى آخر باستخدام ماصة مغناطيسية. تعتاد على عملية ماصة مغناطيسية قبل إجراء الاستخراج. ترتيب الأنابيب التي تحتوي على الكاشف المطلوب لاستخراج في رف.

وهذا يعني، من اليسار إلى اليمين: المخزن المؤقت ملزم، وغسل المخازن المؤقتة، ومخزنة عازلة elution. نقل 1 مل من العينة التركيز إلى أنبوب يحتوي على العازلة ملزمة باستخدام ماصات بلاستيكية المتاح. عكس أنبوب عشر مرات لتحسين الحل.

احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق مع خلط مستمر إما باستخدام مداري منفرد أو يدويا. جمع الجسيمات المغناطيسية باستخدام ماصة المغناطيسية وطرف نظيفة التي يمكن إعادة استخدامها لمخازن الغسيل الثلاثة والافراج عن الجسيمات المغناطيسية في أنبوب يحتوي على غسل العازلة واحد. غسلها عن طريق هز بلطف الحل مع طرف لمدة ثلاثين ثانية وجمعها.

كرر هذا الإجراء غسل لغسل مخازن اثنين وثلاثة. جمع الجسيمات المغناطيسية في العازلة الغسيل ثلاثة والإفراج عنهم في أنبوب يحتوي على عازلة elution. ثم تجاهل الطرف.

احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في حين خلط مستمر باستخدام المدار منفردا. استبدال طرف على ماصة المغناطيسية من قبل أي واحد وجمع كل الجزيئات المغناطيسية من العازلة elution. تجاهل الطرف مع الجزيئات المرفقة.

يبقى حمض النووي في عازلة elution، والتي ينبغي تخزينها لمزيد من التحليل أو الشحن. استخدم خمسة أنابيب وشريط ثلاثي الأنابيب معد للكشف عن الفيروسات الغدية البشرية. إضافة الماء، ومزيج PCR، و extration الحمض النووي إلى أنابيب واحد من خلال خمسة وفقا للبروتوكول.

بعد ذلك، إضافة الماء ومزيج PCR إلى الأنابيب من ستة إلى ثمانية. وضع كلا شرائط في thermocycler وحدد تشغيل المناسبة. بمجرد الانتهاء من تشغيل، وجمع النتائج وتحليل البيانات التي تم الحصول عليها.

فقط عندما تكون الاختبارات الفيروسية قد أسفرت عن السلبية، ينبغي أن يتم الكشف MS2. استخدم شرائط أنبوب أعدت للكشف MS2 وتحديد الملف الحراري المناسب لPCR. تمت مقارنة استخراج الحمض النووي المغناطيسي VirWaTest إلى الحمض النووي QIAGEN الفيروسية الجيش الملكي النيبالي ، وتقليده عن طريق اختبار عينات المياه ارتفعت مع الفيروسات الغدية البشرية وMS2.

انخفاض اختبار ف قيمة يظهر أعلى بكثير من عمليات استرداد الفيروسية باستخدام VirWaTest من QiAgen كأسلوب استخراج لكلا الفيروسات اختبارها. وقد تم اختبار الطريقة المطورة لتركيز الفيروس في الميدان بالتعاون مع فرق غسل أوكسفام الموجودة في بانغي، جمهورية أفريقيا الوسطى، وفي بيدرناليس، إكوادور، التي جمعت عينات من المياه، وركزتها بتطبيق طريقة التركيز المتقدمة، وأرسلتها إلى المختبر في برشلونة لاستخراج الحمض النووي والتحصين الفيروسي. وفي إكوادور، تم الكشف عن الفيروسات الغدية البشرية في جميع العينات التي تم اختبارها، في حين أن واحدة من كل خمس عينات تم جمعها وتركيزها في بانغي كانت إيجابية بالنسبة للفيروسات الغدية البشرية.

وقد أثبتت الطريقة المطورة فائدتها عندما قامت بتقييمها أفرقة غسل من أوكسفام إنترمون في بانغي، بجمهورية أفريقيا الوسطى، وفريق آخر في بيدرناليس، إكوادور. قد يكون VirWaTest جزءاً من نظام الإنذار المبكر أو قد يستخدم في استقصاء الفاشية من قبل المنظمات العاملة في مجال الصرف الصحي للمياه. وتيسر هذه المعدات تحليل مسببات الأمراض الفيروسية في المياه وتحسين إدارة سلامة المياه بهدف الحد من حوادث الأمراض الفيروسية في سياقات الأزمات الإنسانية.