التصوير إنتغرين التوتر وقوة الخلوية في القرار Submicron مع جهاز استشعار توتر التكاملية

هذا الحمض النووي القائم على استشعار التوتر التكاملي، أو ITS، تحويل إشارة القوة إلى الفلوريسنس محليا تمكن التصوير المباشر للقوة الخلوية مع المجهر الفلوري. ITS لديه دقة المكانية العالية وحساسية عالية. عتبة التنشيط هو قابل للتواؤم، مما يسمح صورة انتقائية من التوتر integrin على مختلف المستويات.

بعد تلقي الحمض النووي المخصص واحد تقطعت بهم السبل، أو ssDNA، من الفائدة، لconjugate RGD الببتيد إلى ثيوليتوات SsDNA quencher، أولا إضافة 100 ميكرولترات من 0.5-EDTA المولر في 400 ميكرولترات من الماء إلى حوالي 450 ميكرولتررز من حل TCEP الطازجة. ثم، إضافة 10 ميكرولترات من حل TCEP-EDTA إلى 20 ميكرولترات من واحد ملليمولار ثيول الحمض النووي quencher في برنامج تلفزيوني لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لمقارنه RGD أمين مع sulfo-SMCC، إضافة 40 ميكرولترات من 23 ملليمترا أعدت حديثا sulfo-SMCC إلى 100 ميكرولترات من 11 ملليمولار حديثا 11 ملليمولار أمين حل لاحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

لconjugate RGD أمين SMCC مع ثيوليتوت SsDNA quencher، مزيج من كامل حجم حل ssDNA quencher thiolated مع كامل حجم حل RGD أمين SMCC لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، نقل الحل إلى تخزين أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، اخلطي كلوريد الصوديوم ثلاثي الزحم مع محلول الحمض النووي المتقارن ثيول وناقص 20 درجة مئوية، مبردة، 100٪ إيثانول بنسبة واحد إلى 10 إلى 25، ووضع التفاعل عند ناقص 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

عندما عجل الحمض النووي، وجمع الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني لقياس تركيز الحمض النووي على مطياف. لمستشعر التوتر التكاملي، أو ITS، التوليف، مزيج حلول الحمض النووي حبلا العلوي والسفلي في نسبة 1.1 إلى واحد مولور، واحتضان رد فعل بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية قبل وضع aliquots من الخليط في ناقص 20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. لشليط لها، معطف 29 ملليمتر قطرها، طبق بيتري الزجاج القاع مع 200 ميكرولتر من 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر بيوتينيل بيوتينيبيبي ألبوم المصل البقري، أو BSA-البيوتين، لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.

عندما يكون BSA-biotin قد تمزّم جسديًا على سطح الزجاج ، اغسل الطبق ثلاث مرات بـ 200 ميكرولتر من PBS الطازج لكل غسل ، يليه حضانة مع 200 ميكرولتر من 50 ميكروغرامًا لكل ملليلتر من بروتين avidin لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الطبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح، وإضافة 200 ميكرولترات من 0.1-micromolar ITS لاحتضان آخر لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الطبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، وترك آخر غسل في الطبق حتى طلاء الخلية.

لبدء ثقافة القرنية السمكية، استخدم ملاقط مسطح ة لنتف قطعة من المقياس من سمكة، واضغط بلطف على المقياس على بئر طبق بيتري زجاجي غير معدل، مع الجانب الداخلي من المقياس الذي يتصل بالزجاج. انتظر حوالي 30 ثانية لمقياس الأسماك للتمسك السطح الزجاجي للطبق قبل تغطية المقياس مع ملليمتر واحد من المتوسط الكامل لإيسكوف في Dulbecco المعدلة. ثم، احتضان المقياس في مربع الظلام والرطب لمدة ست إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

لطبقة القراتوسيات على سطح ITS، استبدل الوسيط من طبق ثقافة القرنية القرنية مع محلول فصل الخلايا 1X لاحتضان لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، استبدال حل فصل مع المتوسطة كاملة جديدة، وفك الخلايا مع الأنابيب لطيف. ثم، ضبط الخلايا إلى التركيز المناسب للطلاء، والبذور منها على طبق المغلفة ITS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير.

بالنسبة للتصوير شبه الفعلي للتوتر في الخلايا الحية، قم بنقل الخلايا إلى مرحلة مجهر الفلورسين، وحدد الهدف 40 أو 100 مرة. في برنامج التصوير، قم بتعيين وقت التعرض لثانية واحدة وفاصل الإطار 20 ثانية للحصول على فيديو لصور ITS. ثم، استخدم برنامج تحليل الصور المناسب لطرح إطار سابق من الفيديو ITS من إطار الحالي لحساب إشارة ITS التي تم إنتاجها حديثا في الفترة الأخيرة الإطار.

وتمثل إشارة إي سي إي التي تم إنتاجها حديثاً التوتر المُتَوَكَّد في آخر فاصل زمني للإطار، وبذلك تبلغ عن القوة الخلوية بطريقة شبه آنية. هنا، رسم خرائط التوتر integrin يدل على تحريض التوتر integrin في مسارين قوة أثناء الهجرة قرينة القرنية. ويمكن عندئذ معايرة دقة خريطة القوة لتكون 0.4 ميكرومتر.

ارتفاع التوتر integrin يركز على الهامش الخلفي في القراتوسيات الأسماك الضهر. في الخلايا غير المُمَلَّية، يُشكَّل نمط توتر غير مُحدد مختلف تمامًا عن النمط الذي لوحظ في القراتوسيات المُهاجرة بسرعة. يمكن أن تكون الالتصاقات البؤرية والتوتر integrin من قراتسيات السمك شارك في الصورة لتقييم العلاقة بين التوتر integrin وبنية الخلية في الخلايا ذات الاهتمام.

مع ITS، قوة التصاق الخلية يصبح مرئيا مع قرار وحساسية مماثلة للتصوير الهيكلي الخلية. هذه التقنية تمهد الطريق لدراسة التفاعل بين القوة وبنية في الخلايا.