تصوير ديناميات الكالسيوم في السكان الفرعيين من خلايا الفئران جزيرة البنكرياس

البروتوكول يسمح وظيفة معزولة سريعة من مجموعات فرعية صغيرة من الخلايا داخل الجزر البنكرياسية من Langerhans. وتشمل مزايا هذه التقنية الطبيعة في الوقت الحقيقي والقوة الإحصائية العالية، وبالتالي قابلية التكاثر العالية للبيانات المكتسبة. لشل حركة الجزر للتصوير، قم بتجميع غرفة تصوير لمجهر مقلوب ووضع زلة غلاف زجاجي داخل الغرفة.

تأكد من أن واجهة الغرفة الزجاجية هي ماء وتأكد من أن زلة الغطاء في متناول الهدف المجهر. المقبل، وقطع 20 من 20 ملليمتر المربعات من شبكة غرامة الخشنة واستخدام 45-50 قطعة ميكرومتر من الشريط لزجة سميكة لإنشاء جدارين المسافة على قطعة من شبكة غرامة. غمر الشبكة الخشنة والوزن في طبق بيتري 35 ملليمتر من محلول التصوير ، ووضع الشبكة الدقيقة تحت مجهر تشريح.

بدوره شبكة غرامة مع الجدران الفضاء رأسا على عقب والفواصل التي تواجه صعودا. واستخدام ماصة p20 لنقل العديد من الجزر بين الفواصل اثنين. باستخدام watchmakers'ملقط، وضع شبكة رأسا على عقب داخل غرفة التصوير من المجهر المقلوب بحيث تواجه الفواصل إلى أسفل للجلوس مباشرة على زلة غطاء الغرفة، محاصرة الجزر بين الفواصل والشبكة في منتصف زلة الغطاء.

الحرص على أن شبكة هو رطب بشكل جيد دون أن تحتوي على كميات مفرطة من الحل الذي من شأنه أن يثير الحركة الجانبي للعينة. ثم ضع الشبكة الخشنة والوزن فوق الشبكة الدقيقة في الغرفة ، وأضف حل التصوير إلى الغرفة. وبمجرد أن يتم شلّ الجزر، حدد وضع التصوير والهدف على المجهر المقلوب ووضع الغرفة مع الجزر على مرحلة المجهر التي يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة.

بعد تحديد الضخ، ضع التدفق الداخلي أقل من التدفق الخارجي داخل الغرفة، ويحدد تدفق التدفق إلى الخارج ليكون أكبر من تدفق التدفق إلى الداخل. تأكد من أن التدفق الخارجي له الحد الأدنى من الاتصال مع الحل بحيث يزيل الحل في قطرات صغيرة متتابعة متعددة، مع تجنب الفواصل الزمنية الطويلة لإزالة الحل المستمر. بعد ذلك، ابدأ الضخ مع محلول التصوير الذي يحتوي على ثلاثة جلوكوز ملليمولار، وحدد مسار الضوء والفلاتر لتصوير الفلوروفوريس الخضراء.

ثم تشغيل التصوير الحي لإعداد المعلمات التصوير وضبط طريقة العرض لالتقاط الجزر ذات الأهمية. لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء للصورة، ضبط شدة ضوء الإثارة، ووقت التعرض، وbinning، وضمان أن إعدادات تسمح تصور متميز لكل خلية داخل الجزر في الحد الأدنى من شدة الضوء ممكن والتعرض. ثم صورة الجزر في 0.1 إلى خمسة هيرتز ، والتحقق من نوعية البيانات المكتسبة كما يتم التقاطها.

عندما يكون نشاط الخلية ألفا يمكن اكتشافه، استخدم مخططًا عبر الإنترنت لديناميات الإشارة داخل برنامج الاستحواذ قدر الإمكان وأضف الأدرينالين أو الغلوتامات في محلول الحمام لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. سيتم ملاحظة قفزة سريعة في الكالسيوم تليها تباطؤ أو إلغاء ذبذبات الخلايا ألفا. بعد ذلك، إضافة غريلين، الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرا لتنشيط خلايا الدلتا بشكل انتقائي.

وسوف يلاحظ حدوث زيادة سريعة في الكالسيوم في مجموعة فرعية صغيرة من خلايا الجزير. ثم أضف 10 ملليمولار الجلوكوز. وسوف يلاحظ وجود استجابة متذبذبة منسقة في الخلية الفرعية لخلايا بيتا.

لاحظ أيضاً استجابات الخلايا التي تم تنشيطها سابقاً بواسطة الأدرينالين أو الغلوتامات والغريلين. بعد حفظ الصور، استيراد البيانات إلى برنامج تحليل البيانات المناسبة وتطبيع البيانات كثافة الفلوريسين الخام إلى القيمة الأولية للفلوريسنس. إذا كانت مجموعة بيانات كثافة الفلورانس المتغيرة من الخلية إلى الخلية لا تزال كبيرة، قم بتعريف منطقة تحكم لنطاق الوقت الذي تم خلاله تطبيق حل التحكم.

إذا كانت منطقة التحكم تحتوي على إشارة غير متذبذبة واضحة، افترض أن كثافة الفلوريسين عادت إلى خط الأساس بعد كل تطبيق من حل التحكم. لتصحيح بيانات الفاصل الزمني لكل خلية، قم بتقسيم البيانات إلى أجزاء مفصولة بالنقاط التي تمت بها إضافة حل التحكم وتطبيق التصحيح الخطي على كل قطعة. إذا كان نطاق التحكم تذبذبات واضحة أو عوامل إضافية موجودة، استخدم خوارزمية اكتشاف الارتفاع.

لقياس وتيرة طفرات الكالسيوم والاستجابة لإضافة من ناهضين والخصوم، وتقسيم التسجيل إلى فترات زمنية متساوية، عد المسامير داخل الفاصل الزمني، وتطبيع إلى مدة الفاصل الزمني لحساب الوقت من وتيرة جزئية. بدلاً من ذلك، تعيين عتبة وحساب كسر الهضبة لكل من الفواصل الزمنية. يشير الكسر إلى النسبة المئوية للوقت ضمن الفاصل الزمني الذي استغرقته الخلية في حالة الحماس.

أو حساب المساحة الجزئية تحت المنحنى لكل من الفواصل الزمنية. ما لم يتأثر تكوين الدهون في الغشاء ، فإن الجزر الصغيرة تحمل بشكل جيد مع الأصباغ الاستوائية. الفيروس الغدي البشري من النوع 5 ناقلات أيضا بنجاح يستهدف الخلايا الجزيرة.

يمكن الكشف عن ارتفاع الكالسيوم في خلايا ألفا بسهولة عند مستويات منخفضة من الجلوكوز، وهناك ارتباط عالي بين الخلايا إلى الخلية بين النشاط عند انخفاض الجلوكوز والاستجابة للأدرينالين والغلوتامات. ينشط غريلين بعض الخلايا المتجاوبة مع الأدرينالين عند انخفاض مستوى الجلوكوز، ولكن ليس له تأثير على ديناميات الكالسيوم في معظم الخلايا التي يتم تنشيطها عن طريق انخفاض الجلوكوز. عند تحليلها من حيث التردد الجزئي، الأدرينالين أو الخلايا المحفزة غريلين عرض زيادة كبيرة في ظل ظروف كل شيء أو لا شيء، على الرغم من أن التغييرات الشاملة بين ارتفاع القاعدية وتأثير الأدرينالين هي خفية.

في المقابل، المنطقة الجزئية تحت المنحنى حساسة للتغيرات التي أدخلها الأدرينالين في جميع الخلايا حتى عندما يكون النشاط القاعدي مرتفعًا. تأكد من أن جميع الشبكات على اتصال مع حل التصوير والحرص على وضع الأنسجة كثيفة بشكل معقول لتجنب فقاعات الهواء. ويمكن توسيع هذه الطريقة لتشمل الذكاء الاصطناعي للتمييز بين أنواع الخلايا.

يمكن استبدال العلامات الدوائية بتقنية التعرف على الأنماط ، مما يقلل من وقت التسجيل.