العزلوالتقييم الكمي لخلايا الفرشاة من القصبة الهوائية للفأر
June 12th, 2019
خلايا الفرشاة هي خلايا ظهارية حساسة كيميائية نادرة موجودة في القصبة الهوائية للفأر السذاجة. نظرا لأعدادهم المحدودة، وتقييم من الجسم الحي من دورهم الوظيفي في حصانة مجرى الهواء وإعادة عرض تحديا. نحن نصف طريقة لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية عن طريق قياس التدفق.
وضعنا إجراء لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية, نادرة متخصصة الخلايا الظهارية الكيميائي من الفئران الفلورية الكولين أستيل. ويستند هذا الأسلوب على فصل أولي من ظهارة القصبة الهوائية من submucosa السماح لاحتضان أقصر لاحقة من ورقة الظهارية مع papain. وهذا يسمح لاسترداد قوية من خلايا فرشاة القصبة الهوائية وقد استخدمت بنجاح لعزل وتحليل النسخ للخلايا فرشاة من قبل تسلسل الجيش الملكي النيبالي.
الحضانة الطويلة مع الانزيمات الهضمية يمكن أن تقلل من صلاحية الخلية وتغيير التشكيل الجانبي النسخي للخلايا المعزولة من الأنسجة. هنا نحن فصل ظهارة القصبة الهوائية مع dispase واحتضانها في وقت لاحق مع papain لفترة قصيرة من الزمن إنتاج غلة عالية من خلايا الفرشاة قابلة للحياة. يمكن أن تساهم طريقتنا في دراسات ظهارة مجرى الهواء العلوي.
يمكن تطبيق نفس البروتوكول على عزل خلايا الفرشاة عن مواقع الغشاء المخاطي الأخرى مثل أنسجة الأنف. سوف مظاهرة لدينا تقنية استنساخ للغاية تسمح للعلماء الأقران لعزل ومواصلة التحقيق في خلايا فرشاة القصبة الهوائية. لبدء هذا الإجراء، إضافة dispase وDNase الأول إلى برنامج تلفزيوني في التركيزات النهائية هو مبين هنا لإعداد حل الهضم dispase.
تأكد من أن مسحوق dispase هو حل كامل قبل الاحماء الحل في حمام مائي في 37 درجة مئوية. بعد ذلك، أضف 5٪ FBS المعطلة للحرارة إلى DMEM لإعداد حل إيقاف. لإعداد المخزن المؤقت Tyrode الأول ، إضافة papain وL - السيستين إلى العازلة التيرود HEPES دون الكالسيوم.
لإعداد العازلة التيرود الثاني، إضافة لوبيتين إلى العازلة HEPES تيرود دون الكالسيوم بتركيز اثنين من microliters لكل ملليلتر. لإعداد المخزن المؤقت FACS، استخدم محلول الملح المتوازن من هانك بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والأحمر الفينول المكمل مع اثنين من ملليمولار EDTA و 2٪ FBS. بعد القتل الرحيم الماوس، واستخدام 21 الإبر قياس لإصلاحه على لوحة جراحية في موقف supine مع الأطراف العليا والسفلية الموسعة.
رش الفراء مع الإيثانول 70٪ لتعقيم المنطقة. باستخدام ملقط مستقيم، ورفع الجلد والفراء من البطن واستخدام مقص تشريح لجعل شق في المركز. باستخدام المقص، وفصل الجلد من الأنسجة تحت الجلد من البطن إلى المناديلا.
أثناء حمل الأنسجة تحت الجلد مع ملقط، وجعل شق صغير مع مقص في وسط جدار البطن. ثم افتح الصفاق مع شق على شكل حرف V. باستخدام ملقط، نقل بلطف الأمعاء الدقيقة إلى الجانب.
تحديد موقع الشريان الأورطي البطني وفينا كافا وجعل شق مع مقص تشريح للسماح لssanguination سريع. حددي مكان الحجاب الحاجز باستخدام إبرة قياس 18، وجعل فتحة في الحجاب الحاجز فقط تحت القص لتفريغ الرئتين.
باستخدام مقص حاد مدبب مستقيم، وقطع على طول قاعدة الأضلاع لفصل الحجاب الحاجز بعناية من القفص الصدري. استخدام ملقط لرفع الطرف المكشوف من القص وقطع طولي القص من قاعدة القفص الصدري إلى الرقبة. استخدم مقصًا قصيرًا مستقيمًا لإجراء شق عنق الرحم المركزي وفصل فصوصين من الغدة دون الرّامن.
بعد ذلك، استخدم زوج من ملقط عالية الدقة دقيقة نقطة لإزالة بعناية النسيج الضام المحيطة و الصعتر الصعترية الإفراط في carina. تشريح القصبة الهوائية الحرة أولا عن طريق فصل نهاية قريبة على مستوى epiglottis ومن ثم تشريح نهاية النهاية البعيدة على مستوى التشعب من القصبة الهوائية. حدد موقع epiglottis وقطع القصبة الهوائية طوليا من epiglottis إلى كارينا.
للبدء، ضع القصبة الهوائية في أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على 750 ميكرولترات من محلول الهضم المُندمج المُدفأ مسبقًا إلى 37 درجة مئوية. تغطية أنبوب مع رقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء المباشر واحتضان على شاكر في 200 دورة في الدقيقة وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. ثم إضافة 750 ميكرولترات من DMEM مع 5٪ FBS لوقف التفاعل ووضع الأنبوب على الجليد.
نقل القصبة الهوائية إلى طبق بيتري. قم بتوجيه القصبة الهوائية مع الجانب الظهاري الذي يواجهك. القصبة الهوائية التشريحية طولياً لها شكل شبه أسطواني تحتفظ به الحلقات الكرتيلاجية.
الظهارة على السطح المقعر. باستخدام ملقط مستقيم، ربط منطقة epiglottis من القصبة الهوائية إلى طبق بيتري واستخدام مشرط حجم 22 التخلص من كشط الظهارة قبالة القصبة الهوائية. سوف تنفصل الطبقة الظهارية كرقبة شفافة.
استخدم المشرط لتمرم الظهارة ونقل الطبقة الظهارية إلى أنبوب ملليلتر. شطف طبق بيتري مع 750 ميكرولترات من Tyrode الأول العازلة ونقل هذا إلى أنبوب يحتوي على طبقة الظهارية. تغطية أنبوب مع رقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء المباشر واحتضان في 37 درجة مئوية على شاكر في 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
ثم إضافة 750 ميكرولترات من الباردة التيرود الثاني العازلة. دوامة الأنسجة هضم بقوة لمدة 20 إلى 30 ثانية. باستخدام حقنة تعلق على إبرة قياس 18، triturate المتجانس 10 مرات.
بعد هذا، انتقل إلى إبرة قياس 21 و triturate 10 إلى 20 مرة أخرى. تصفية الخلايا من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. إضافة المخزن المؤقت FACS الباردة في نسبة حجمية من 30 إلى واحد.
أجهزة الطرد المركزي في 350 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في عازلة FACS الباردة. نقل هذا التعليق إلى 12 في 75 ملليمتر البوليسترين أنبوب.
مرة أخرى في أجهزة الطرد المركزي 350 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل الماوسين و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة FACS. بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من الأجسام المضادة المضادة للماوس CD1632 لمنع الربط غير المحدد واحتضان الجليد لمدة 15 دقيقة.
ثم إضافة الأجسام المضادة في عناصر التحكم isotype المعنية كما هو موضح في بروتوكول النص. احتضان على الجليد لمدة 45 دقيقة في حين محمية من الضوء المباشر. بعد هذا، إضافة 4.5 ملليلتر من المخزن المؤقت FACS الباردة ومزيج.
أجهزة الطرد المركزي في 350 مرة ز و4 درجات مئوية. تجاهل supernatant وإعادة فرض بيليه في 300 microliters من عازلة FACS الباردة. إضافة يوديد البروديوم مباشرة قبل تدفق الفرز السيتومتري.
في هذه الدراسة، يتم عزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية من ChAT eGFP أستيل أستيل الفلورسنت الفئران مراسل بنجاح لتسلسل الحمض النووي الريبي. يتم تحديد الخلايا من الحطام بزاوية التشتت الأمامية والجانبية. يتم استبعاد Doublets باستخدام ارتفاع التشتت الأمامي والعرض وارتفاع التشتت الجانبي والعرض.
تكون المضاعفة هي الخلايا التي تحتوي على قيم ذات عرض عالي. داخل الخلايا الفردية، يتم تعريف الخلايا الحية على أنها السكان التي هي الأيودينيوم البروديويد السلبية. ضمن الخلايا المفردة الحية، يتم تحديد الخلايا المنخفضة إلى السالبة CD45 استناداً إلى عنصر تحكم isotype.
ضمن الخلايا السلبية المنخفضة CD45، تكون الخلايا الإيجابية EPCAM التي هي أيضاً eGFP موجبة في قناة FITC مجموعة خلايا الفرشاة. يتم تغيير أرقام الخلايا الفرشاة من خلال التعرض لمستقلبات الميكروبية والبروتوزوا، وبالتالي تعكس تباين الميكروبات المؤسسية. لذلك، فإننا نقترح تقدير عدد خلايا الفرشاة عن طريق المجهر الفلوريس لقياس العدد المتوقع من خلايا الفرشاة المعزولة عن طريق فرز تدفق السيتوميترية.
تأكد من فصل الطبقة الظهارية من القصبة الهوائية بشكل صحيح لأنها تحدد غلة خلايا الفرشاة المعزولة. يمكن استخدام خلايا الفرشاة القصبية المعزولة في مجموعة واسعة من المقايسات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، واستزراع الخلايا والتحليل الوظيفي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لعزل خلايا الفرشاة الرغامية، وهي خلايا طلائية كيميائية عصبية كولينية نادرة في القصبة الهوائية للفأر. تعمل التقنية على تعزيز استعادة هذه الخلايا للتحليل الوظيفي في مناعة وإعادة تشكيل المسالك الهوائية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- فيزيولوجيا الجهاز التنفسي
الخلفية
- خلايا الفرشاة الرغامية هي خلايا طلائية متخصصة.
- تلعب دورًا في مناعة المسالك الهوائية.
- يعد عزل هذه الخلايا تحديًا بسبب ندرتهن.
- الطرق الموجودة يمكن أن تضر بحيوية الخلية.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لعزل خلايا الفرشاة الرغامية.
- تعزيز فهم أدوارها الوظيفية.
- تسهيل التحليل النسخ من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي.
الطرق المستخدمة
- فصل الظهارة الرغامية عن تحت المخاطية.
- تحضين قصير بالباباين للحفاظ على حيوية الخلية.
- استخدام الديسبيز لفصل فعال للظهارة.
- استعادة عالية العائد للخلايا الفرشاوية الحية.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح لخلايا الفرشاة الرغامية.
- معدلات عالية من حيوية الخلايا المعزولة.
- تسمح الطريقة بتحليل ناسخ لاحق.
- تساهم في دراسات ظهارة المسالك الهوائية العلوية.
الاستنتاجات
- الطريقة المطورة فعالة لعزل خلايا الفرشاة.
- تحافظ على حيوية الخلية والسلامة النسخية.
- يمكن لهذه التقنية أن تتقدم بالبحث في بيولوجيا المسالك الهوائية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Isolation of rare chemosensory epithelial cells enables mechanistic de-risking of airway biology targets by providing a validated biological system for functional interrogation. This method supports target validation and assay development in respiratory disease research by delivering viable, transcriptionally intact brush cells for downstream analysis. The procedure enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological variability associated with enzymatic dissociation artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cholinergic chemosensory pathways in airway epithelial cells for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible source of viable brush cells for functional validation of airway targets.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through transcriptional profiling of isolated brush cells via RNA sequencing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized epithelial sheets for consistent preparation of brush cell suspensions in assay workflows.
- Operational Value: Short papain incubation preserves cell viability and transcriptional integrity for reliable functional readouts.
- Scientific Value: Enables quantitative evaluation of brush cell responses to microbial metabolites and protozoa exposure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling of upper airway epithelium for preclinical target validation.
- Operational Value: Offers a transferable protocol applicable to brush cell isolation from nasal and other mucosal tissues.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by linking brush cell variability to institutional microbiota exposure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling isolation of rare epithelial cells for hypothesis-driven target validation and pathway clarification prior to screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of airway targets through viable brush cell isolation and transcriptional analysis.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions suitable for compound screening and functional assay development.
- Analytics: Provides quantitative outputs via flow cytometry and RNA sequencing for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through disease-relevant upper airway epithelium modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for brush cells across multiple mucosal sites and respiratory disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preservation of cell viability and transcriptional profiles.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined enzymatic dissociation steps and buffer preparations.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early functional analysis of rare chemosensory cells.
- Portfolio Impact: Informed go/no-go decisions based on brush cell response variability to microbial metabolites.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epithelial dissection and enzymatic tissue processing.
- Dependent on access to dispase, papain, and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates standardization of epithelial sheet separation for consistent brush cell yields.
- Involves adaptation considerations for applying the protocol to nasal or other mucosal tissues.
- Limited by the rarity of brush cells, necessitating fluorescence microscopy for yield estimation prior to sorting.
