تنفيذ مجهريانعكاس التداخل للتصوير عالي السرعة وخالٍ من الملصقات من الأنابيب الدقيقة
أغسطس 8, 2019
هذا البروتوكول هو دليل لتنفيذ مجهريانعكاس التداخل على مجهر الفلورة القياسية للتصوير خالية من التسمية، عالية التباين، عالية السرعة من microtubules باستخدام الأسطح في المختبر الاختبارات.
أهمية هذا البروتوكول هو أنه يقدم تقنية التصوير خالية من التسمية قادرة على الحصول على صور عالية التباين في معدلات الإطار عالية أبسط وأرخص من التقنيات الأخرى مثل DIC والمجال المظلم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من السهل تنفيذها وسهلة الاستخدام. انها غير مكلفة ويمكن دمجها مع المجاهر الفلوريسنس بسهولة.
تم تطوير هذه الطريقة لتصور ميكروتومات الفردية. لديها القدرة على أن تستخدم لتصور مجمعات البروتين الكبيرة والجسيمات النانوية. الصعوبة الرئيسية هي الطاقة التنشيط المطلوبة العبث مع مكعب مرشح لإضافة مرآة نصف الفضة.
نصيحتي لشخص يحاول هذه التقنية للمرة الأولى هو فقط القيام بذلك. للبدء، أدخل مرآة 50/50 في عجلة التصفية من المجهر الفلوري باستخدام مكعب مرشح مناسب. التعامل مع المرآة بعناية في كثير من الأحيان لديهم مكافحة الانعكاس الترميز.
أنتقل إلى هدف التكبير عالية التي لديها أيضا فتحة رقمية عالية. واحد هو مبين هنا هو هدف النفط 100x مع فتحة رقمية من 1.3. بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة وشريحة مجهر كحافة مستقيمة لقطع شرائط عرض ثلاثة ملليمترات من فيلم البارافين البلاستيكي.
مكان اثنين من البلاستيك شرائط فيلم البارافين ثلاثة ملليمترات على حدة نظيفة 22 من 22 ملليمتر غطاء زلة، ثم وضع زلة غطاء 18 في 18 ملليمتر على رأس الشرائط لتشكيل قناة. نقل زلة الغطاء إلى كتلة الحرارة في 100 درجة مئوية لمدة 10 إلى 30 ثانية لفيلم البارافين لتشكيل قناة مختومة. باستخدام ماصة، تدفق في 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة مضادة للرودامين عن طريق التسريب واحتضان الشريحة لمدة 10 دقائق.
بعد الحضانة، وغسل القناة خمس مرات باستخدام BRB80 المصفاة، ثم تدفق في 1٪ Poloxamer 407 في BRB80 تمت تصفيتها لمنع السطح ضد الربط غير محددة واحتضان الشريحة لمدة 10 دقائق. مرة أخرى، غسل القناة خمس مرات باستخدام BRB80 المصفاة. لمنع العينة من الجفاف، أضف قطرتين من BRB80 المصفاة عند أطراف القناة وأضف المزيد من المخزن المؤقت حسب الحاجة.
ضع العينة على مرحلة المجهر ودرِّر مصدر ضوء الإنارة epi-illumination. التركيز على حافة فيلم البارافين للعثور على سطح العينة ومن ثم نقل الحقل لتعيين وجهة نظر إلى وسط الغرفة. سوف نلاحظ أسطح متعددة كما يتم نقل الهدف صعودا وهبوطا بسبب انعكاس الخلفية للضوء من البصريات داخل المسار البصري.
بعد ذلك، مركز الحجاب الحاجز في مجال الرؤية عن طريق إغلاقه في منتصف الطريق واستخدام مسامير التكيف. بمجرد محاذاة الحجاب الحاجز بشكل صحيح، إعادة فتحه. ثم، الانزلاق في عدسة برتراند لعرض الطائرة الخلفية المحورية، والمعروف أيضا باسم التلميذ الخروج من الهدف.
أغلق الحاجز الحاجز فتحة خارج حواف التلميذ الخروج واستخدام مسامير التكيف لمركز الحجاب الحاجز فتحة فيما يتعلق بتلميذة الخروج. الاختيار المزدوج عن طريق فتح الحجاب الحاجز فتحة وتطابق حوافه مع تلك التلميذ الخروج. ثم، تعيين الحجاب الحاجز فتحة إلى حوالي ثلثي الفتحة العددية للهدف.
للبدء، قم بتعيين وقت التعرض للكاميرا إلى 10 مللي ثانية وضبط الإضاءة لتشبع النطاق الديناميكي للكاميرا تقريبًا. بعد ذلك ، استخدم ماصة للتدفق في 10 ميكرولترات من ميكروتوبيومات GMPCPP المستقرة في 0.22 ميكرومتر تمت تصفيتها BRB80. مراقبة الربط microtubule على التصوير من السطح.
مرة واحدة 10 إلى 20 microtubules هي مقيدة داخل مجال الرؤية، وغسل العينة مرتين مع BRB80 المصفاة. الحصول على 10 صور من microtubules عن طريق إعداد الفاصل الزمني مع التعرض 10 ميلي ثانية وفترة تأخير ثانية واحدة لما مجموعه 10 ثانية. ثم، الحصول على صور خلفية عن طريق تحريك المرحلة باستخدام وحدة تحكم المرحلة على طول محور القناة الطويل في حين الحصول على 100 صورة مع أي تأخير.
لصورة microtubule ديناميات باستخدام tubulin الدماغ، تبدأ عن طريق تعيين درجة حرارة سخان العينة إلى 37 درجة مئوية. باستخدام ماصة، تدفق في 10 ميكرولترات من بذور ميكروتوبومي المستقرة GMPCPP ورصدها ملزمة على السطح عن طريق تصوير السطح على الهواء مباشرة. مرة واحدة 10 إلى 20 بذور ملزمة ضمن مجال الرؤية، وغسل العينة باستخدام ضعف حجم قناة BRB80 قبل الدافئة وتصفيتها.
بعد ذلك، تدفق في 10 ميكرولترات من مزيج البلمرة. لقياس نمو microtubule ، قم بإعداد فترة زمنية باستخدام برنامج الاستحواذ للحصول على صورة كل خمس ثوان لمدة 15 دقيقة. تعزيز التباين من خلال الحصول على صورة متوسطة من 10 في كل نقطة زمنية.
الحصول على صور خلفية كما هو موضح في المقطع السابق. حساب الوسيط عن طريق الانتقال إلى الصورة، وتحديد المكدس، ثم مشروع Z، ثم الوسيط. طرح الخلفية المقابلة عن طريق الذهاب إلى معالجة، والذهاب إلى آلة حاسبة الصورة، واختيار طرح من القائمة المنسدلة.
تأكد من تحديد خيار نتيجة تعويم 32 بت. بالنسبة لانكماش المجهر، احصل على صور بمعدل 100 إطار في الثانية عن طريق تعيين تأخير الوقت إلى الصفر والحفاظ على وقت التعرض عند 10 مللي ثانية. عامل مهم للحصول على صور عالية التباين مع التداخل المجهرية هو تعيين الفتحة العددية للإضاءة بشكل صحيح.
ويمكن القيام بذلك عن طريق توجيه حجم شعاع الإضاءة عند تلميذ الخروج من الهدف ، والتي يتم التحكم فيها من خلال حجم الحجاب الحاجز الفتحة. باستخدام عينة من فلورسنت المسمى استقرت microtubules، وجلب microtubules في التركيز باستخدام مقبض المجهر التركيز في حين التصوير الفلوري لهم. تعيين تعريض الكاميرا إلى 10 مللي ثانية وإغلاق الحجاب الحاجز فتحة إلى أصغر فتحة لها.
أيضا، ضبط الإضاءة لتشبع تقريبا النطاق الديناميكي للكاميرا أو حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى. احصل على 10 صور من خلال تدفق حقل رؤية يحتوي على 10 ميكروتومات أو أكثر. ثم الحصول على صورة خلفية.
تغيير حجم الحجاب الحاجز وضبط كثافة الإضاءة لتتناسب مع ما تم تحديده سابقا. الحصول على 10 صور جديدة وخلفية جديدة. كرر هذه العملية حتى يتم الانتهاء من نطاق كامل من الحجاب الحاجز.
لكل مجال من مجالات الرؤية المكتسبة، طرح الخلفية المقابلة ومتوسط الخلفية الناتجة طرح الصور كما هو مبين سابقا. ثم، حساب متوسط إشارة إلى نسبة الضوضاء الخلفية من microtubules لكل حجم الافتتاح. تعيين حجم الحجاب الحاجز إلى واحد إنتاج أعلى إشارة إلى نسبة الضوضاء الخلفية.
فمن الممكن أن هناك مجموعة من الأحجام التي تنتج مقارنة على النحو المبين هنا. مع مجهر جيد الانحياز، يجب أن تكون microtubules مرئية دون طرح الخلفية. طرح الخلفية، ومع ذلك، لا يعزز التباين من microtubule.
لزيادة تعزيز التباين، يمكن استخدام المتوسط، 4a تصفية، أو مزيج من كليهما. تصف عمليات مسح الأسطر الموضحة هنا التحسين المتزايد لجودة الصورة. هذه تصف انخفاض ملحوظ من الضوضاء الخلفية مع كل خطوة المعالجة.
يمكن الإبلاغ عن ديناميات Microtubule في kinographs ، والتي يتم إنشاؤها من أفلام هفوة الوقت. ويرد هنا مثال كينوغراف تم الحصول عليه بمعدل إطار قدره 0.2 إطار في الثانية. خطوط متقطعة علامة البذور.
عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم العمل مع أهداف الفتحة الرقمية العالية. من المهم أيضًا محاذاة حجم إطار قطر الفتحة وتعيينه بشكل صحيح. فمن السهل الجمع بين IRM مع التصوير الفلوري لدراسة، على سبيل المثال، microtubule ملزمة البروتينات وكيف أنها تعدل ديناميات microtubule.
هذه التقنية يقلل من تلف الصورة إلى حد كبير ويسمح للحصول على معدل أعلى الإطار، مما يجعل من الأسهل لدراسة biopolymers المسمى مثل microtubules لفترات طويلة من الزمن مع دقة زمنية عالية ودقة تتبع جيدة.
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول تقنية تصوير بدون ملصقات لتصوير دقيق عالي السرعة للأنابيب الدقيقة باستخدام مجهر الانعكاس التداخلي على المجاهر الفلوري المعيارية. تم تصميمه ليكون أبسط وأكثر فعالية من حيث التكلفة من الطرق التقليدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات المجهر
الخلفية
- يتيح مجهر الانعكاس التداخلي تصوير عالي التباين بدون ملصقات.
- تعتبر هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لتصور الأنابيب الدقيقة والمجمعات البروتينية الكبيرة.
- من الأسهل تنفيذها مقارنة بالتقنيات مثل DIC والمجهر الميدان المظلم.
- يتضمن البروتوكول خطوات مفصلة لتحضير العينات وتحسين ظروف التصوير.
غرض الدراسة
- توفير بروتوكول مباشر لتصوير الأنابيب الدقيقة باستخدام مجهر الانعكاس التداخلي.
- لتبرير التطبيقات المحتملة لهذه التقنية في تصور هياكل بيولوجية مختلفة.
- لتبسيط عملية الحصول على صور عالية الجودة بطريقة فعالة من حيث التكلفة.
الطرق المستخدمة
- تحضير العينات باستخدام فيلم البارافين لإنشاء قنوات لربط الأنابيب الدقيقة.
- استخدام مجهر فلوريسنت مع مكعبات مرشحات ومرايا محددة.
- تصوير التسلسل الزمني لمراقبة ديناميكيات ونمو الأنابيب الدقيقة.
- اكتساب صورة خلفية لتعزيز التباين.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح للأنابيب الدقيقة بدرجة عالية من التباين والسرعة.
- تبين سهولة استخدام وتنفيذ التقنية.
- إمكانية التطبيق في دراسة المجمعات البروتينية الكبيرة والنانو الجسيمات.
- توفير بروتوكولات تصوير مفصلة تعزز من إمكانية التكرار.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة للباحثين في مجال المجهر وعلم الخلية.
- يسلط الضوء على مزايا تقنيات التصوير بدون ملصقات.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى مجالات بحثية بيولوجية وطبية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Label-free, high-speed imaging of microtubules addresses a key discovery-stage challenge in studying cytoskeletal dynamics without perturbing native function. Interference reflection microscopy (IRM) provides predictive confidence in target validation by enabling quantitative measurement of microtubule length and dynamics with high temporal resolution. This supports early de-risking of therapeutic hypotheses involving microtubule-targeting agents or associated regulatory proteins.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microtubule dynamics as a therapeutic hypothesis without fluorescent labels that could alter protein function.
- Operational Value: Provides label-free contrast compatible with standard fluorescence microscopes, reducing reagent costs and phototoxicity concerns.
- Predictive Confidence: Allows measurement of microtubule length with precision up to 20 nm and bandwidth of 10 Hz, supporting quantitative assessment of compound effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-contrast, label-free images suitable for automated analysis of microtubule binding and polymerization kinetics.
- Operational Value: Uses wide-field illumination and sCMOS cameras, enabling scalable imaging across large fields of view limited only by camera performance.
- Assay Readiness: Background subtraction and image averaging enhance signal-to-noise ratio, supporting reproducible compound screening in 384-well or higher formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by visualizing microtubule dynamics in vitro under physiological conditions (37°C) with minimal photodamage.
- Operational Value: Enables long-term time-lapse imaging (e.g., 15-minute growth assays) at high frame rates, facilitating kinetic analysis of microtubule-targeting compounds.
- Translational Continuity: Compatible with fluorescence imaging, allowing correlation of label-free structural data with fluorescently tagged binding proteins or post-translational modifications.
Pipeline & Workflow Integration
IRM fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for compounds modulating microtubule stability or motor protein activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying microtubule growth and shrinkage rates in response to perturbations, enabling mechanistic de-risking of targets.
- Screening: Delivers quantitative outputs (length, growth rate, catastrophe frequency) that allow comparison across compound libraries or genetic conditions.
- Analytics: Enables calculation of signal-to-background ratios and kinograph generation from time-lapse movies, providing objective metrics for hit validation.
- Translational Research: Connects to preclinical work by maintaining microtubule integrity over extended imaging periods, supporting dose-response and target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Requires only a fluorescence microscope, half-silver mirror, and paraffin film, making it a low-cost, reusable platform across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing label-free, high-speed visualization of microtubule dynamics without photobleaching or photodamage.
- Operational Value: Standardizes imaging via aperture diaphragm optimization and background subtraction, improving reproducibility across users and sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on cytoskeletal function, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microtubule-modulating compounds through quantitative, label-free phenotypic readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, particularly aperture diaphragm and condenser adjustment for optimal signal-to-noise ratio.
- Needs a fluorescence microscope with filter cube capable of holding a 50/50 mirror and high-NA objective (e.g., 100x oil, NA 1.3).
- Demands standardization of sample preparation steps, including paraffin film channel formation and surface blocking with Poloxamer 407.
- Adaptation to other model systems may require optimization of surface chemistry and incubation times for target binding.
- Practical limitation: Initial setup involves manual alignment of aperture diaphragm to exit pupil, which may require training for consistent results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Microscope Modification and Chamber Preparation
2:32
Microscope Alignment
3:43
Control: Imaging Stabilized Microtubules
4:43
Imaging Microtubule Dynamics
6:28
Properly Setting the Aperture Diaphragm Size
8:11
Results: IRM Imaging of Microtubules Dynamics and Contrast Enhancement using Image Processing
9:02
Conclusion
