تقييم التعريب الخاص بنواه عدسه Zebrafish والنزاهة التكوينية

بروتوكولاتنا توفر نقطة انطلاق للدراسات الوظيفية لتطوير عدسة وعلم وظائف الأعضاء والفرز الجيني العكسي للعدسة الظاهرية في حمار وحشي. لدينا بروتوكولات جسر في المختبر وفي تحليلات في الجسم الحي من عدسة الحمار الوحشي غشاء مورفولوجيا وتوفير طريقة جديدة ومباشرة لتحديد حجم تطور بصريات عدسة حمار وحشي. تحليل عدسة الحمار الوحشي مورفولوجيا والبصريات يؤدي إلى رؤى في آليات التحكم في تطور العدسة، وعلم وظائف الأعضاء الطبيعي، والفيزيولوجيا المرضية.

هذه الأفكار يمكن أن تؤدي بدورها إلى القدرة على تأخير أو منع إعتام عدسة العين. لم تكن هناك تقارير في الأنواع الأخرى غير حمار وحشي من نوى عدسة غير متناظرة محلية. تحديد خياطة العدسة أمر بالغ الأهمية لتوجيه العدسة بشكل صحيح لقياس توطين النواة.

بعد تأكيد التخمير الكافي مع Tricaine ، استخدم مقص microdissection لاستخراج كلتا العينين على الفور من شخص بالغ أو حمار وحشي يرقات ووضع كلتا العينين في طبق بيتري مخصص 35 ملليمترًا مع قالب تشريح سيليكون مليء بـ PBS. لحصاد العدسة من حمار وحشي بالغ، ضع الجانب الخلفي للعين لأعلى وأدخل ملقطًا بزاوية أقل من 45 درجة من خلال القرص البصري. استخدم مقص التشريح لإجراء شقين أو ثلاثة شقوق شعاعية عبر الشبكية وشقة من القرص البصري إلى منطقة الهدليس في العين المُشلّلة وقشر الشبكية وشقّة شبكية العين مثل بتلات الزهور.

عكس العين، القرنية الجانب، واستخدام الجانب المسطح من مقص لشل العدسة بشكل غير مباشر عن طريق التلاعب من تصلب والقرنية باستخدام ملقط لسحب بعيدا الشبكية والأنسجة المرفقة، ثم تقليم بعناية بعيدا أي الأنسجة الزائدة من العدسة. لحصاد عدسة حمار وحشي اليرقات، ضع الجانب الخلفي للعين اليرقات على الجزء المسطح من طبق سيليكون من PBS واستخدم إبرة تنغستن شحذ لإجراء تخفيضات شعاعية من خلال شبكية العين وشقيلة في حين شل حركة العين مع إبرة أخرى أو ملقط، ثم مغرفة بلطف العدسة من العين المنفصلة مع الجانب الحاد من الإبرة التنغستن سلكية الصنع حسب الطلب وسحب بعناية بعيدا الأنسجة المرفقة. لقياس نواة نواة المحور الأمامي الأمامي الخلفي ، قم بتوجيه العدسات الطازجة المُخترة بشكل خفي في PBS في طبق من 35 ملليمتر مع قاع زجاجي غطاء مع القطبين والخياطة الموجهة بالتوازي مع مستوى التركيز.

لتحديد نواة العدسة، ابحث عن اختلاف في مؤشر الانكسار، والذي يحدث عادة عند واجهة قشرة العدسة ونواة العدسة. إذا كانت خياطة العدسة غير ظاهرة، فإن لعقة طفيفة مع ملقط إلى كبسولة العدسة تكشف عن الغرز ونواة العدسة، مما يساعد على توجيه العدسة للقياس. ضع الطبق على خشبة مسرح مجهر تشريح مجهز بكاميرا وصورة العدسات مع نواة العدسة في التركيز تحت الإضاءة الساطعة أو مع البصريات التباين التداخل التفاضلي.

صورة ميكرومتر تحت نفس التكبير للمعايرة وانقر على عرض مباشر. انقر فوق لقطة للحصول على صورة وحفظ الصورة كملف TIFF. لمعايرة الصور العدسة المكتسبة، في برنامج مناسب معالجة الصور، حدد أداة خط مستقيم ورسم خط من طول معروف على صورة ميكرومتر.

انقر على تحليل وتعيين مقياس وأدخل المسافة والوحدات المعروفة، ثم حدد المعايرة العمومية وانقر فوق موافق. لقياس المسافة من مركز نواة العدسة إلى القطب الأمامي، تحديد موقع خياطة العدسة واستخدام أداة الخط المستقيم لرسم خط عبر مركز الصورة من نواة العدسة في اتجاه محوري. مركز هذا الخط هو مركز نواة العدسة. رسم خط آخر من هذه النقطة إلى القطب الأمامي للعدسة وحدد قياس في القائمة تحليل لقياس المسافة.

رسم خط آخر من القطب الأمامي إلى القطب الخلفي وقياس هذه المسافة وقطر العدسة، ثم نسخ هذه الأطوال من نافذة النتائج إلى جدول بيانات وحساب توطين تطبيع نواة العدسة فيما يتعلق نصف قطر العدسة. قبل ثلاثة أيام بعد الإخصاب ، تتشكل الغرز الأمامية في القطب الأمامي ويتم تصور التقارب المذهل للخلايا بوضوح عن طريق تلطيخ phalloidin لأغشية الخلايا الليفية الضيقة في الأجنة الثابتة. أقوى واسعة الألياف خلية وضع العلامات في غشاء عدسة المترجمة mApple المعدلة وراثيا يسمح التصور الحية من الغشاء دون نطاقات ولكن يفتقر إلى التقارب sutural.

يمكن تصور الغرز الخلفي في المختبر وفي الجسم الحي في ثلاثة أيام بعد الإخصاب. في الطائرة الاستوائية، phalloidin تسميات بقوة الخلايا الألياف القشرية الخارجية، والكشف عن شكل سداسية بالارض. يتم استبعاد Phalloidin من نواة العدسة المضغوطة ونوع البرية والعدسة متحولة تبدو لا يمكن تحديدها.

تكشف العلامات القوية لخلايا الألياف العريضة في فسيفساء mApple المترجمة للعدسة عن اضطرابات في حجم الخلية داخل العدسة المتحولة. كما التعبير transgene لا يقتصر على نفاذية، تكشف بعض الفسيفساء نواة عدسة التسميات. في الحيوانات من النوع البري، تبدأ نواة العدسة أقرب إلى قطب العدسة الأمامية خلال المراحل المبكرة من التطور قبل أن مركزية خلال مرحلة البلوغ.

التعبير عن البروتينات الخضراء الموسومة في مضيف المعدلة وراثيا حيث الأغشية الخلوية الفلورية الحمراء يسمح في وقت واحد توطين البروتين وكذلك تقييم مورفولوجيا الخلية الألياف في الجسم الحي. حمار وحشي هي مناسبة بشكل خاص ل في دراسات الجسم الحي. باستخدام الأدوات المذكورة هنا، يمكننا التحقيق آليات العدسة، درس إلى حد كبير في المختبر، في نظام في الجسم الحي.