في فيفو الحقن المجسمة داخل الدماغ لتحفيز البصريات من المدخلات بعيدة المدى في شرائح الدماغ الماوس
سبتمبر 20, 2019
يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق لتحديد الاتصال الوظيفي الخاص من نوع الخلية من المدخلات طويلة المدى من مناطق الدماغ البعيدة باستخدام التحفيز البصري في شرائح الدماغ في الجسم الحي السابق.
والهدف من هذه الطريقة هو تحديد الاتصال الوظيفي للمدخلات بعيدة المدى من مناطق الدماغ البعيدة باستخدام المحفزات الضوئية في شرائح الدماغ. إن الاستهداف المجسم لمنطقة معينة من الدماغ لمختلف التعبيرات المتوسطة للقنوات الأيونية الحساسة للضوء يسمح بالتحفيز الانتقائي للفأس الهوائية القادمة من تلك المنطقة مع الضوء. إثبات الإجراء سيكون لويس ريتشفو، طالب دكتوراه من مجموعتي.
قبل الجراحة، تحقق من أن الحيوان مُقَدَّد بشكل جيد مع قرصة إصبع. سحب بلطف لسانه لتسهيل التنفس. ثم، حلق الشعر القحفي.
حقن 20 ميكرولتر من هيدروكلوريد ليدوكاين تحت جلد الرأس للتخدير الموضعي والانتظار لمدة خمس دقائق. لفضح الجمجمة، وجعل قطع على فروة الرأس. ثم ضع الحيوان في إطار مجسم.
أدخل قضبان الأذن وأراحها على العظام قليلاً إلى الأذنين واسحب الجلد لخلق وصول جيد إلى الجمجمة. تشديد أشرطة الأذن وتثبيت قطعة الأنف. الحفاظ على جسم الحيوان أفقيا وعلى مستوى الرأس باستخدام دعم ارتفاع المعدلة.
وضع وسادة التدفئة تحت الحيوان للحفاظ على درجة الحرارة الفسيولوجية. ثم تنظيف الجمجمة عن طريق تطبيق 0.9٪ كلوريد الصوديوم مع مسحة القطن لإزالة الأنسجة الرخوة. ضبط الجمجمة بحيث يتم تسوية وصول bregma لامدا.
ثم، تحديد موقع الحقن على الجمجمة وفقا لإحداثيات الخلفية ووسيل ووضع إبرة الحقن فوقه. وضع علامة على الجمجمة بإبرة يمكن التخلص منها. في وقت لاحق، تحريك إبرة الحقن إلى أعلى بمقدار أربعة سنتيمترات.
باستخدام 0.5 ملليمتر البور، وخلق واحد ملليمتر قطرها القحف على علامة في نصف السرعة القصوى. مسحة مع الأنسجة إذا حدث أي نزيف. بعد ذلك، إفراغ المياه الواردة في حقنة هاملتون للتخزين عن طريق إخراجه تماما مع مضخة.
فقط إبرة مليئة بالماء. ذوبان الحل الفيروسي ليتم حقنه على الجليد، ثم، إزالته لفترة وجيزة من الجليد والحصول على 700 نانويترات من الحل مع ميكروسيبيت. بعد ذلك ، إيداع قطرة على قطعة من فيلم البارافين.
ضع فيلم البارافين على قمة استئصال القحف. يغرق الإبرة في قطرة من محلول الفيروسية دون تغيير موقف anteroposal الأمامي والجانبي. بعد ذلك ، استخدم وظيفة سحب المضخة لملء الحقنة مع حوالي 500 نانولترات من الحل الفيروسي على فيلم البارافين.
تنفيذ هذا الإجراء تحت المنظار المجسم، ومشاهدة انخفاض تختفي، وتأكد من عدم التعرق أي الهواء. تأكد من أن الحقنة قد تم ملؤها بشكل صحيح. اختبار نظام طرد عن طريق القيادة أسفل المكبس لاختبار إخراج قطرة صغيرة من السائل.
في وقت لاحق، أدخل الإبرة في الدماغ إلى العمق المختار. اضغط على زر التشغيل للحقن. ثم، ببطء سحب الإبرة على مدى ثلاث إلى خمس دقائق.
غسل الإبرة فورا في المياه المقطرة النظيفة عن طريق ملء إفراغ عدة مرات من أجل تجنب انسداد. بعد ذلك، قم بإزالة الحيوان من الإطار المُجسم. خياطة الجلد وجعل ثلاث أو أربع غرز تعادل مع عقدة جراحية قياسية 2-1-1.
لاستخراج الدماغ ، وجعل قطع على الجلد من الرقبة إلى الأنف ، ثم قسم آخر فقرة من الجمجمة مع مقص. سحب الجلد وقطع الجمجمة على طول خط الوسط من السد إلى الاتجاه الرستري. إزالة بعناية العظام الجدارية والجزء السد من العظام الأمامية.
استخراج الدماغ مع ملعقة مدورة صغيرة عن طريق إدراجه بين الدماغ والكلمة القحفية، وقسمة لمبة الشم، والعصب البصري، وغيرها من الأعصاب القحفية والمخيخ. غمر الدماغ بلطف في محلول قطع الجليد البارد. في وقت لاحق, نقل الدماغ إلى ورقة مرشح وتجفيف بلطف السطح القشرية.
الغراء قشرة الدماغ إلى حامل العينة من هزاز مع الجانبcaudal التي تواجه شفرة من أجل قطع شرائح الدماغ الأفقي. المقبل، وملء غرفة القطع مع الجليد الباردة حل قطع الأكسجة حتى الدماغ هو immerged تماما. قسم 300 شرائح ميكرومتر سميكة مع اهتزاز بسرعة 07 ملليمتر في الثانية في السعة ملليمتر واحد.
في هذه المرحلة، من المستحسن أن تحقق بإيجاز من التعبير كرونوس-GFP في المهاد باستخدام مصباح يدوي فلوري ونظارات مرشح المقابلة. لتنفيذ تسجيل المشبك التصحيح الخلية الكاملة، نقل بلطف شريحة الدماغ التي تحتوي على مجمع قرن آمون إلى غرفة التسجيل. باستمرار اثقب غرفة التسجيل مع 34 درجة مئوية ACSF فقاعة مع كاربوجين في 2-3 ملليلتر في الدقيقة الواحدة.
قم بفحص التعبير الكرونوس-GFP في محطات محور عصبي في المنطقة ذات الاهتمام مع إضاءة LED زرقاء عند التكبير 4X. تغيير إلى 63X الغمر الهدف وضبط التركيز. تحقق من وجود محاور تعبر عن كرونوس-GFP واختر خلية عصبية هرمية لتسجيل التصحيح.
المقبل، تعبئة ماصة مع محلول غلوكونات البوتاسيوم القائم على الداخلية. جبله في حامل الماصات على المسرح الرئيسي. تصحيح الخلية في تكوين الجهد المشبك.
الاقتراب من الخلايا العصبية المحددة واضغط بدقة على طرف ماصة على سوما. الضغط الإيجابي يجب أن تنتج غمة على سطح الغشاء. ثم، الافراج عن الضغط لإنشاء ختم gigoOm.
مرة واحدة مختومة، تعيين الجهد عقد إلى ناقص 65 millivolts. كسر الغشاء مع نبضة حادة من الضغط السلبي. تسجيل ردود الخلايا العصبية لفرط الأقطاب و depolarizing الخطوات الحالية في وضع المشبك الحالي الخلية الكاملة.
سجل في التيار أو الجهد الردود بعد المشبك 475 نانومتر LED تحفيز الميدان كله من الألياف afferent التعبير عن كرونوس. تحفيز مع القطارات من عشرة التحفيزات من اثنين من مدة ميلي ثانية في 20 هيرتز. تم تسجيل نشاط الخلايا العصبية قبل الubsubicular في الطبقة الثالثة استجابة لفرط الأقطاب والخطوات الحالية في تكوين التصحيح الخلية بأكملها المشبك.
حفز محطات محور عصبي ADN التعبير عن كرونوس-GFP أثار إمكانات ما بعد متشابك مثير في الطبقة ما قبل الubsubicular ثلاث خلايا رئيسية في الوضع المشبك الحالي. ويمكن أن تصل الملوثات EPSPs، حسب كثافة الضوء، إلى عتبة محتملة للعمل. كما لوحظت استجابات ما بعد التشابك في وضع المشبك الجهد، كما تم استثارة التيارات ما بعد متشابك.
يظهر هنا هو طبقة ثلاثة الخلايا العصبية الهرمية محاطة محاور ثالامية التعبير عن كرونوس-GFP في طبقات سطحية presubicular مع DAPI تلطيخ الصورة مع مجهر epifluorescence. وقد التقطت هذه الصورة في تكبير أعلى مع مجهر confocal. التسوية الدقيقة للbregma على طول المحور في إجراء التجارب التجريبية مع التتبع الفلورسنت حاسمة لتحسين دقة حقنة ستيريو.
ويمكن أيضاً استخدام هذا الإجراء في استقصاء الإسقاطات المتقاربة من مناطق مختلفة عن طريق الحقن في مشهدين مولدين حساسين لأطوال موجية مختلفة. وقد سمح تطور هذه التقنية بدقة التشريحية والوظيفية تحليل الدوائر بين مناطق الدماغ البعيدة بطريقة محددة نوع الخلية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول أساليب لتحديد الاتصال الوظيفي المحدد لنوع الخلية للإدخالات بعيدة المدى من مناطق الدماغ البعيدة باستخدام التحفيز الضوئي الوراثي في شرائح الدماغ ex vivo. توظف الدراسة التحفيز الضوئي لتفعيل أطراف المحور العصبي المحددة، مما يمكن الباحثين من دراسة الاستجابات المشبكية في مجموعات الخلايا العصبية المستهدفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربية
- الضوئي الوراثي
الخلفية
- فهم الاتصال الوظيفي في الدماغ أمر بالغ الأهمية لتوضيح الشبكات العصبية.
- يسمح الضوئي الوراثي بالتحكم الدقيق في النشاط العصبي باستخدام الضوء.
- تستخدم الطريقة شرائح الدماغ ex vivo لتسهيل التسجيلات والتعاملات الخلوية.
غرض الدراسة
- استكشاف الروابط الوظيفية بين مناطق الدماغ المحددة.
- لتقييم الاستجابات الإثارية والمثبطة للعصبونات المستهدفة بعد التحفيز.
- لتأسيس بروتوكول يمكن تطبيقه على نطاق واسع على أنواع الخلايا العصبية والوصلات المختلفة.
الطرق المستخدمة
- يستخدم شرائح الدماغ ex vivo من الحيوانات المهدأة.
- يتم استهداف مناطق الدماغ المحددة للتلاعب الضوئي الوراثي باستخدام قنوات أيونية حساسة للضوء.
- تشمل الخطوات الحرجة التحضير الجراحي، والحقن الفيروسي، وتحضير الشرائح.
- يتم إجراء تسجيل الكمشة الكاملة للخلية لقياس استجابات الخلايا العصبية.
النتائج الرئيسية
- ثبت أن التحفيز الضوئي يثير إمكانات ما بعد المشبك الإثاري في الخلايا العصبية الهرمية.
- تنوعت الاستجابات مع شدة الضوء، مما يشير إلى تعديل الفعالية المشبكية.
- حددت ديناميكيات النقل المشبكي في الخلايا العصبية السابقة للحصين عن طريق قياسات المشبك الحالية.
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة بروتوكولًا قويًا للتحقيق في الاتصال الوظيفي بعيد المدى في الدماغ.
- تسلط الضوء على إمكانات التقنيات الضوئية الوراثية لتوضيح الآليات المشبكية وأنماط الاتصال.
- تساهم في فهم كيفية تفاعل مجموعات الخلايا العصبية المختلفة ومعالجة المعلومات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Precise mapping of long-range synaptic connectivity is essential for de-risking target validation and advancing mechanistic understanding in CNS drug discovery. This protocol enables selective optogenetic stimulation of defined neuronal inputs, supporting predictive confidence in functional circuit interrogation. The approach strengthens early discovery decisions by clarifying pathway-specific contributions to neuronal signaling and disease-relevant phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables cell-type and pathway-specific interrogation of synaptic connectivity for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of neuronal targets by isolating long-range input effects.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and downstream signaling.
Screening & Assay Development
- Provides a validated ex vivo system for quantitative measurement of synaptic responses.
- Standardizes optogenetic stimulation parameters for reproducible assay outputs.
- Enables reliable evaluation of pharmacological modulation at defined synapses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional circuit analysis with disease-relevant brain regions and pathways.
- Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of CNS targets.
- Reduces translational risk by enabling direct measurement of functional connectivity changes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation in neuroscience portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective activation of defined neuronal projections.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative synaptic readouts suitable for pharmacological assessment.
- Analytics: Provides electrophysiological measurements of postsynaptic responses for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant models by targeting specific brain circuits.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable platform for functional circuit interrogation across CNS programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes optogenetic and electrophysiological workflows for scalable implementation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust functional data on circuit-level effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on functional connectivity evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery, viral vector handling, and patch-clamp electrophysiology.
- Demands access to fluorescence imaging, optogenetic stimulation, and electrophysiological recording infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of injection coordinates and stimulation protocols.
- Adaptation to different brain regions or neuronal populations may require pilot validation.
- Precision in targeting and expression is critical to minimize off-target effects and maximize interpretability.
