طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

Drosophila الميلانوغاستر هو نموذج قوي لتقييم في الجسم الحي الآثار السامة والغدد الصماء المحتملة من المواد الكيميائية، مثل الغدد الصماء، التي تمثل مشكلة خطيرة لصحة الإنسان والبيئات الطبيعية. معالجة تأثير EDCs على سمات الحياة الهرمونية للذبابة ، مثل البراز والخصوبة ووقت النمو والعمر الافتراضي. إنها طريقة سهلة ورخيصة وسريعة للتحقيق في اضطراب الغدد الصماء في الجسم الحي.

يمكن أن تتأثر الخصوبة والتنمية والعمر الافتراضي في دروسوفيليا بعدة عوامل يجب التحكم فيها بعناية لضمان النتيجة الناجحة لهذا البروتوكول. لذلك ، مطلوب أقصى قدر من الاهتمام في تربية الذباب والتعامل معه. لمقايسة طعم EDC المختارة ، بعد التخدير ، نقل 15 ذبابًا صغيرًا من السرير المتطاير إلى أربع قوارير متوازية تحتوي على متوسط دقيق الذرة الممزوج بتلوين الطعام.

تحتوي قارورة التحكم على المذيبات وحدها ، ويتم استكمال قوارير الثلاث الأخرى بجرعات مختلفة من EDCs المختارة. احتفظ بالقنينات في حاضنة مرطبة ليوم واحد مع ضوء طبيعي لمدة 12 ساعة. بعد تخدير الذباب مرة أخرى، نقل الذباب غير المُشلَّم إلى ورقة بيضاء، ووضعها تحت مجهر ستيريو لمراقبة.

قارن تلوين البطن لكل مجموعة من مجموعات العلاج فيما يتعلق بمجموعة التحكم. لمقايسة الأداء الإنجابي للذباب، وإعداد ثلاث قوارير من الذباب لكل EDC كما قارورة الوالدين، مع ثماني إناث وأربعة ذكور في 10 ملليلتر من متوسط دقيق الذرة تستكمل مع EE2. للسيطرة، وإعداد ست قوارير من الذباب، كل مع ثماني الإناث وأربعة ذكور في 10 ملليلتر من الغذاء متوسط دقيق الذرة تكملها المذيبات EE2.

الخلفية تطير في حاضنة في 25 درجة مئوية. أثناء نموها ، تجنب اكتظاظ اليرقات. بعد أربعة أيام، عكس كل قارورة على الأثير لإزالة الآباء وإعادة القنينات إلى الحاضنة لمدة خمسة أيام أخرى.

في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم التاسع، عكس كل قارورة على الأثير لإزالة جميع الذباب ظهرت حديثا من قوارير ووضع قارورة في حاضنة أخرى في 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم 10، على محطة عمل 2 أكسيد الكربون Drosophila، عكس بعناية قارورة الثقافة لمنع الذباب تخدير من السقوط على المتوسطة وإدراج أنبوب مطاطي مع إبرة في القارورة بين سدادة القطن وجدار القارورة. افتح الصمام لتوصيل ثاني أكسيد الكربون.

في غضون ثوان، نقل الذباب إلى سرير ذبابة تحت المجهر. جمع العذراء الإناث والذكور الصغار بشكل منفصل في مجموعتين على السرير يطير. تقسيم عشوائي كل مجموعة من الذباب في مجموعات فرعية صغيرة، مع 10 الإناث أو 20 الذكور لكل قارورة مليئة الطازجة مطابقة دقيق الذرة المتوسطة.

مواصلة حضانة وجمع 30 عذراء الإناث و 30 الذكور لكل EDC، و 90 الإناث العذراء والذكور 90 الذكور للسيطرة. بيت هذه المجموعات من الذباب في 25 درجة مئوية حتى أنها تبلغ من العمر أربعة أيام بعد انهيار. ثم نقلها إلى قارورة جديدة تحتوي على وسيط جديد مطابق كل يومين.

تحقق من عدم وجود يرقات في قوارير الإناث. ثم قم بتسمية قوارير بسلسلة مختلفة من الأرقام المتسلسلة للعلاج التالي. بعد التخدير، نقل أنثى واحدة EE2 المذيبات المعالجة إلى قارورة صغيرة تحتوي على طماطم دقيق الذرة الطازجة المتوسطة دون EE2 وإضافة واحد EE2 المذيبات المعالجة الذكور للسيطرة عبر.

إقران ذكر EE2 معاملة مع الإناث EE2 المعالجة المذيبات أو الإناث EE2 المعالجة مع الذكور EE2 المعالجة بالمذيبات لكل علاج. منزل 20 واحد الصلبان في 25 درجة مئوية. نقل كل زوج التزاوج إلى قنينات الطماطم الطازجة الطماطم المتوسطة دون EDC كل يوم لمدة 10 أيام لاحقة.

فحص بصريا كل قارورة كل يوم للبيض والإبلاغ عن رقمها على جدول الخصوبة. في كل قارورة، تحقق عن كثب للذباب الناشئ حديثاً وسجل العدد اليومي للذروة البالغة على مدى فترة 10 أيام. بعد 10 أيام من التزاوج الأولي، إزالة الآباء من السلسلة الأخيرة من قوارير.

في بروتوكولات فحص الكسر ، أولاً ، لكل مجموعة علاجية ، وضعت 10 قوارير من الذباب الصغير السليم أقل من يومين ، كل منها مع ست إناث وثلاثة ذكور في 10 ملليلتر من طعام دقيق الذرة دون EDC. تربية الذباب على الطعام لمدة 24 ساعة والسماح لهم بالتزاوج. ثم قم بإعداد 10 قوارير متوازية أخرى لكل مجموعة معالجة مع 10 ملليلترات كل من أغذية دقيق الذرة الطازجة المكملة لتركيزات EDC مختلفة أو مذيب EE2 وحده للتحكم.

نقل الذباب تزاوج إلى هذه القوارير الجديدة. قم بعمل جدول بيانات تطويري لتسجيل السلسلة المختلفة. السماح للذباب لوضع البيض لمدة 16 ساعة.

ثم، إزالة الآباء من قارورة. احتضان القنينات في 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام، أو حتى اليرقات تجول مرئية. كل يوم، عد عدد من pupae جديدة في كل قارورة عن طريق كتابة رقم في تسلسل من قبل كل خادرة على السطح الخارجي للقارورة لتجنب عد نفس pupa مرتين.

الإبلاغ عن عدد من pupae ظهرت حديثا لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام، أو حتى لا أكثر شكل pupae. بدءا من اليوم التاسع، عد عدد البالغين الناشئين يوميا، حتى لا يظهر المزيد من البالغين. الإبلاغ عنها على جدول التنمية وأداء بقية فحص الزخرفة وفقا للمخطوطة.

في بروتوكول العمر الافتراضي، وضعت لأول مرة 20 قنينة مع ثماني إناث وأربعة ذكور، كل مليئة 10 ملليلتر من الغذاء دقيق الذرة وسكن لهم في 25 درجة مئوية. بعد أربعة أيام، تخلص من الذباب ووضع القنينات مرة أخرى في الحاضنة. في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم التاسع، إزالة جميع الذباب ظهرت حديثا من قارورة والعودة قارورة إلى الحاضنة.

بعد 16 إلى 24 ساعة، تقسيم 250 الذباب البالغ من العمر يوم واحد من كلا الجنسين إلى أربع مجموعات تحت التخدير ثاني أكسيد الكربون الخفيف ونقلها إلى زجاجات 250 ملليلتر تحتوي على الغذاء المتوسط الكبار، وثلاثة تستكمل مع تركيزات مختلفة EDC وواحدة مع المذيبات EE2 وحدها. الحفاظ على الذباب في 25 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام للسماح لهم بالتزاوج. ثم، فرز كل فوج من الذباب حسب الجنس في مجموعتين.

في كل حالة علاج، لكلا الجنسين، تقسيم كل مجموعة بشكل عشوائي إلى خمس قوارير متوازية بكثافة 20 فردًا لكل قارورة. إعداد جدول بيانات عمر يتم فيه طرح عدد الذباب الميت من عدد الذباب الباقي من النقل السابق، بحيث يتم الحصول على عدد الناجين في كل عملية نقل تلقائياً. بعد ثلاثة أيام، نقل الذباب دون تخدير إلى قنينات جديدة تحتوي على الغذاء المقابل في نفس الوقت والتحقق من الموت.

سجل عمر الذباب وعدد الذباب الميت. كرر النقل كل ثلاثة أيام حتى يموت كل الذباب. في هذه التجربة، تم رسم منحنيات العمر على أنها الناجين التراكمي مقابل الأيام المنقضية لكل تركيز EDC والتحكم.

بالنسبة للسيطرة، بعد فترة أولية طويلة حيث ظل منحنى الناجين مرتفعًا نسبيًا، انخفض بشكل كبير بعد حوالي 60 يومًا. وفي أعقاب التعرض للذباب المعالجة، تأثر منحنى الناجين من الذباب المعالج تأثراً كبيراً، وأظهر انخفاضاً كبيراً بعد 36 يوماً. ينصح حول أن قنينات موازية قيد التحليل ينبغي أن تكون مشابهة جدا، وإلا فإنه سيكون من الصعب أن نفهم أي لتجاهل.

لذلك، نقترح الحرص الشديد، واعتماد ممارسة تجريبية جيدة، وذلك باستخدام حجم عينة كبيرة. وبعد هذه البروتوكولات، من الممكن أيضاً تقييم الأثر العابر للأجيال لمخلِّفات الغدد الصماء المختارة، وكذلك اختبار الآثار المضافة المحتملة لمزيج من مختلف تشوهات الغدد الصماء.