Name: الكتابة الجينية لعنابة النعمان البحرية خلال التنمية المبكرة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: اكتشف تقنية الكتابة الجينية غير القاتلة لعنابة النعمان البحرية Nematostella vectensis خلال التنمية المبكرة. تتيح هذه الطريقة للباحثين تحديد الطفرات الوراثية دون إتلاف الأجنة، مما يُسهّل دراسة التطور بعد الجنين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر المراجعين المجهولين على تعليقاتهم على النسخة السابقة من المخطوطة، التي حسنت المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل بأموال من جامعة أركنساس.

1. تحريض التفريخ، والإخصاب في المختبر، وإزالة هلام
<ol><li>الحفاظ على vectensis Nematostella في مياه البحر مع ملوحة من 12 أجزاء في الألف (ppt) في الظلام في 16 درجة مئوية، وتغذية Artemia يوميا.</li>
	<li>في اليوم السابق للتفريخ التعريفي، ضع الحيوانات في حاضنة تعمل بدرجة الحرارة والضوء. برنامج الحاضنة بحيث تتعرض الحيوانات إلى 8 ح من الضوء في 25 درجة مئوية. اختياري: إطعام قطعة صغيرة (<1 مم3)من المحار للالحيوانات الفردية قبل وضعها في الحاضنة لتعزيز التفريخ.</li>
	<li>ترك الحيوانات في الحاضنة لمدة 1 ساعة في 16 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة الحيوانات من الحاضنة وتركها على سطح مقاعد البدلاء مع الضوء في درجة حرارة الغرفة (RT) للسماح تفرخ. عادة ما يحدث التفريخ في غضون 1.5-2 ساعة التالية.</li>
	<li>إذا كان الذكور والإناث في حاويات منفصلة، ضع حزم البيض من حاوية الإناث في حاوية الذكور التي تحتوي على الحيوانات المنوية باستخدام ماصة نقل الذي يتم قطع طرفه لتوسيع الفتحة بحيث لا تتلف البيض من الإجهاد الميكانيكي أثناء نقل. السماح بتخصيب البيض بتركهم في حاوية الذكور لمدة 15 دقيقة على الأقل.</li>
	<li>دي جيلي حزم البيض في مياه البحر التي تحتوي على 3٪ سيستين (درجة الحموضة 7.4) على طبق بيتري أو في أنبوب 15 مل. يهيّج بلطف على شاكر لمدّة 12 دقيقة.</li>
	<li>استخدام ماصة بلاستيكية لتفريق كتل والاستمرار في التحريض لمدة 2-3 دقيقة أخرى حتى تماما دي jellied.</li>
	<li>إزالة السيستين عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع مياه البحر العذبة لمدة 5X على الأقل.</li>
	<li>احتفظ بالبيض المخصبة على طبق بيتري زجاجي عند درجة حرارة 16 درجة مئوية أو RT.</li>
</ol>2. الاستئصال الجراحي للأنسجة الأبالمنة من جنين غازيولا
<ol><li>إعداد مخزن استخراج الحمض النووي يتكون من 10 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8)، 50 مل ككل، 1 MM EDTA، 0.3٪ توين20، 0.3٪ NP40، و 1 ملغ / مل بروتيناز ك. استخدام 20 مل من المخزن المؤقت استخراج لكل جنين. يُمزج جيداً عن طريق التَحَمِل ويُخلط العازل في أنابيب PCR.</li>
	<li>إذابة 1٪ أغاروز في مياه البحر وصب في طبق بيتري لتغطية الجزء السفلي. تبرد على سطح المقعد لجعل سرير هلام. صب مياه البحر الطازجة لتغطية السرير هلام في طبق بيتري.</li>
	<li>نقل 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) الأجنة (مرحلة مبكرة إلى منتصف gastrula) في طبق بيتري الذي يحتوي على سرير هلام أغاروز.</li>
	<li>إدراج إبرة التنغستن في حامل إبرة وتعقيم عن طريق غمس طرف إبرة في الكحول (70٪ أو أعلى) ووضعها في اللهب لحرق الكحول.</li>
	<li>تحت المجهر تشريح (في 20x إلى 40x التكبير)، واستخدام إبرة التنغستن لجعل الاكتئاب على سرير أجاروز عن طريق إزالة قطعة من الأجاروز السطحية حول حجم الجنين ليتم التلاعب بها، ووضع الجنين على الاكتئاب مع الجانبية الجانب التي تواجه أسفل من أجل تقييد حركة الجنين للجراحة الدقيقة.</li>
	<li>استخدام إبرة التنغستن لاستئصال جراحيا قطعة من الأنسجة الأبوالية تقع قبالة فتح blastoporal عن طريق الفم. عادة ما يكون الأوفيرال من ثلث إلى ربع الأنسجة الجنينية على طول المحور الفموي - الأبوالي كافياً.</li>
	<li>استخدم ماصة P20 لنقل الأنسجة الأبوالية المعزولة (بالداخل و2 مل) إلى أنبوب PCR يحتوي على 20 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي.</li>
	<li>نقل الجنين بعد الجراحة إلى بئر تحتوي على ما لا يقل عن 500 مل من مياه البحر العذبة في لوحة 24-أو 96 جيدا.</li>
	<li>كرر الخطوات 2.4-2.8 لعدد الأجنة حسب الحاجة.</li>
	<li>ضع لوحة البئر التي تحتوي على أجنة ما بعد الجراحة في حاضنة عند درجة حرارة 16 درجة مئوية أو RT حتى يتم الانتهاء من الكتابة الجينية.</li>
</ol>3- استخراج الحمض النووي الجيني والنمط الجيني من الـ PCR
<ol><li>تدور لفترة وجيزة أسفل أنابيب PCR التي تحتوي على المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي والأنسجة الجنينية المعزولة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (على سبيل المثال في 2680 × ز لمدة 10 ق).</li>
	<li>لاستخراج الحمض النووي الجيني من الأجنة المفردة، احتضان أنابيب PCR في 55 درجة مئوية لمدة 3 ح. دوامة لمدة 30 s كل 30 دقيقة لضمان تفكك كتل الخلايا وتعزيز تحليل الخلايا.</li>
	<li>احتضان أنابيب PCR في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل proteinase K.</li>
	<li>احتفظ بمستخلصات gDNA عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو على الجليد، ثم انتقل على الفور إلى PCR. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا عن طريق وضع مستخلصات gDNA في فريزر -20 درجة مئوية.</li>
	<li>إعداد رد فعل PCR باستخدام gDNA المستخرجة كقالب لتضخيم موضع الفائدة الجينومية.<ol>
<li>إذا كانت الأليلات مختلفة في موضع الاهتمام تختلف في الحجم بحيث يمكن الكشف عن الفرق حجم من قبل الكهربائي هلام أغاروز، وتصميم مجموعة واحدة من التمهيديات لتضخيم المكان بأكمله.</li>
		<li>بدلا من ذلك، استخدم التمهيديات الخاصة بالأليل التي تولد منتجات PCR فقط في وجود أليل محددة؛ على سبيل المثال، من خلال تصميم التمهيدي الذي يربط إلى منطقة تحتوي على الطفرات الإدراج / الحذف.</li>
		<li>استخدام مزيج نموذجي من تفاعل PCR 20 مل على النحو التالي: 5 مل من مستخلصات gDNA، 8 مل من المياه الخالية من النوكليس، 4 مل من المخزن المؤقت PCR، 0.2 مل من 10 mM dNTPs، 0.6 مل من DMSO، 1 مل من 10 مل التمهيدي إلى الأمام، 1 مل من 10 مل التمهيدي العكسي ، و 0.2 مل من بوليميراز الحمض النووي (انظر جدولالمواد). ملاحظة: يمكن استخدام العديد من المواد التمهيدية في رد فعل PCR. على سبيل المثال، يمكن الجمع بين التمهيدي العالمي إلى الأمام واثنين من التمهيديات العكسية الخاصة بآليل، طالما تم تصميم التمهيديين العكسيين لتوليد منتجات PCR من أحجام متميزة بحيث يمكن أن يكون وجود / غياب الأليلات اثنين لا لبس فيه يحددها الكهربائي هلام (انظر قسم النتائج التمثيلية).</li>
	</ol>
</li>
	<li>تشغيل الأوجاروز جل الكهربائي لتحديد حجم ووجود / غياب منتجات PCR. ضبط حالة الأوغاروس جل الكهربائي (على سبيل المثال، نسبة هلام أغاروز، V / سم، والمدة) اعتمادا على الحجم المتوقع من منتجات PCR.</li>
	<li>استخدم نتائج PCR فيما يتعلق بحجم ووجود/غياب منتجات PCR لتعيين نمط جيني لكل جنين ما بعد الجراحة. على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع أن تولد الأليلات المختلفة منتجات PCR من أحجام مختلفة، استخدم معلومات الحجم لتعيين النمط الجيني لكل جنين. وفي حالة استخدام المواد التمهيدية الخاصة بالأليل، ينبغي استخدام البيانات المتعلقة بوجود/عدم وجود منتجات الـ PCR لتعيين نمط جيني لكل جنين.</li>
	<li>فرز الأجنة وفقا للنمط الجيني.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.

وصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR إلى النمط الجيني لجنين النعمان البحر واحد دون التضحية الحيوان. بعد التفريخ وإزالة هلام، يسمح للبيض المخصبة أن تتطور إلى gastrulae. تتم إزالة المنطقة الأبالة لكل جنين غازيولا جراحيا، ويستخدم الأنسجة الأبوروفال المعزولة لاستخراج الحمض النووي الجيني اللاحقة، في حين أن الأجنة المتبقية بعد الجراحة تلتئم وتواصل التطور. ثم يتم استخدام مقتطفات gDNA لإجراء فحص PCR لتحديد النمط الجيني لكل جنين. هذه الطريقة تستفيد من قدرة النصفين الفمويين من جنين النعمان البحري على تنظيم وتطوير10</su...

يمثل الكنيداريون مجموعة متنوعة من الحيوانات التي تشمل قنديل البحر والشعاب المرجانية وشاطئ النعمان البحري. وهي ثنائية الخلايا، تتكون من ectoderm وendoderm التي يتم فصلها بواسطة مصفوفة خارج الخلية (mesoglea). Cnidaria هي مجموعة شقيقة لspeciose Bilateria، والتي نماذج الحيوانات التقليدية مثل دروسوفيلا وموس تنتمي1. بالإضافة إلى ذلك، يعتقد أن الاختلاف Cnidaria-Bilateria قد حدث في فترة ما قبل الكمبري2. وعلى هذا النحو، فإن الدراسات المقارنة للسكانيين والبلاتيريين ضرورية للحصول على رؤى في بيولوجيا أسلافهم المشتركين الأحدث. في الآونة الأخيرة، كشفت علم الجينوم المقارن أن cnidarians وbilaterians حصة العديد من الجينات مجموعة أدوات التنمية مثل الشق وbHLH، مما يعني أن أسلافهم المشتركة لديها بالفعل هذه الجينات3. ومع ذلك، فإن دور هذه الجينات مجموعة أدوات التنمية في السلف المشترك الأخير من Cnidaria وBilateria هو أقل فهما بالمقارنة جيدا. ولمعالجة هذه المشكلة، من الأهمية بمكان دراسة كيفية عمل هذه الجينات المحفوظة بعمق في الكنيداريين.
واحدة من النماذج الوراثية cnidarian الناشئة هو الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis. وقد تم تسلسل الجينوم3، ومجموعة متنوعة من الأدوات الوراثية ، بما في ذلك المورفولينول بوساطة الجينات بالضربة القاضية ، وtransgenesuclease بوساطة transgenes ، وكريسبر-Cas9 بوساطة الجينات knockins وخروج المغلوب ، متاحة الآن للاستخدام في هذا الحيوان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير نيماتوستيلا مفهوم بشكل جيد نسبيا. أثناء تكوين الجنين، يحدث التطفل عن طريق المهبل4، ويتطور الجنين إلى يرقة بلنبولا السباحة الحرة. وتتحول البلنة في وقت لاحق إلى ورم مسيل مع الفم والمخالب المحيطة. ثم ينمو ورم ويصل إلى النضج الجنسي.
كريسبر-Cas9 بوساطة الطفرات المستهدفة يستخدم الآن بشكل روتيني لدراسة وظيفة الجينات في نيماتوستيلا vectensis5,6,7,8,9. لتوليد متحولين بالضربة القاضية في Nematostella، يتم حقن كوكتيل يحتوي على locus محددة واحدة دليل RNAs والبروتين Cas9 endonuclease لأول مرة في البيض غير المخصبة أو المخصبة لإنتاج الحيوانات مؤسس F0 التي تظهر عادة الفسيفساء. يتم رفع الحيوانات F0 في وقت لاحق إلى النضج الجنسي وعبرت مع بعضها البعض لإنتاج السكان F1، مجموعة فرعية منها قد تكون متحولة بالضربة القاضية6. بدلا من ذلك، يمكن عبور الحيوانات F0 ناضجة جنسيا مع الحيوانات البرية من نوع لتوليد الحيوانات Heterozygous F1، وF1 heterozygotes التي تحمل أليل بالضربة القاضية في موضع الاهتمام يمكن بعد ذلك أن عبرت مع بعضها البعض لإنتاج ذرية F2، ربع منها من المتوقع أن تكون متحولة بالضربة القاضية5. ويتطلب كلا النهجين طريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من السكان غير المتجانسين وراثيا. يمكن استخدام مخالب البولي لاستخراج الحمض النووي الجينيللكتابة الجينية 6،7. ومع ذلك، في الحالات التي يتم فيها التحقيق في الوظيفة التنموية لجين الاهتمام ولا تصل الأجنة المتحولة إلى مرحلة البول (أي بسبب فتك اليرقات المرتبطة بالطفرة)، يجب تحديد المتحولين بالضربة القاضية في وقت مبكر من الأنطوجيني. يوصف هنا هو بروتوكول يستند إلى PCR للالحيوانات الفردية النمط الجيني في مرحلة gastrula دون التضحية الحيوان، والتي تمكن من تحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة.

<table><tbody><tr><td>ذبابة الفاكهة بلتيير حاضنة مبردة</td><td>شلاب</td><td>SRI6PF</td><td>تستخدم في تحريض التفريخ</td></tr><tr><td>ملح البحر الفوري للمحيط</td><td>المحيط</td> الفوري <td>138510</td><td></td></tr><tr><td>أكياس الروبيان المالح</td><td>Aquatic Eco-Systems، Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine Hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>شاكر مداري قياسي ، موديل 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl ، 1 متر ، درجة حموضة 8.0</td><td>جودة بيولوجية</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA ، 0.5 متر pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>بديل Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40</td> محلول بروتيناز <td>K البيولوجي الأمريكي</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>(20 مجم / مل) ، ThermoFisher بدرجة الحمض النووي</td> الريبي <td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>حامل إبرة تشريح دقيق</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>إبرة تشريح التنغستن</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة</td><td>نيو إنجلاند BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP مزيج</td><td>نيو إنجلاند BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamide التمهيدي</td><td></td><td></td> الأمامي العالمي <td>5'- CATGCGGAGACCAAGCCAAGGC-3 '</td></tr><tr><td>التمهيدي العكسي الخاص ب glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'</td></tr><tr><td>التمهيدي العكسي الخاص ب glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td></tr></tbody></table>

الكتابة الجينية لعنابة النعمان البحرية خلال التنمية المبكرة

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

يوصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR للنمط الجيني للجنين مرحلة gastrula من الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis دون التضحية بحياة الحيوان. بعد الإخصاب في المختبر وإزالة هلام، يسمح zygotes لتطوير لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة للوصول إلى مرحلة مبكرة إلى منتصف gastrula. ثم توضع أجنة غازترولا على سرير جل أغاروز في طبق بيتري يحتوي على مياه البحر. تحت المجهر تشريح، يتم استخدام إبرة التنغستن لفصل جراحيا جزء من الأنسجة الأبال من كل جنين. ثم يسمح للأجنة بعد الجراحة بالشفاء ومواصلة النمو. يتم استخراج الحمض النووي الجينومي من جزء الأنسجة المعزولة واستخدامه كقالب لPCR خاص بالموقع. ويمكن تحديد النمط الجيني على أساس حجم منتجات PCR أو وجود/عدم وجود منتجات PCR الخاصة بالأليل. ثم يتم فرز الأجنة بعد الجراحة وفقا للنمط الجيني. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة وتمكن من تحليل الأنماط الظاهرية أثناء التنمية.

جينوم نيماتوسلا لديه موضع واحد أن ترميز بروتين السلائف لGLWamide neuropeptide. وقد تم الإبلاغ عن ثلاثة أليليس متحولة بالضربة القاضية في هذا المكان(glw-a,glw-b,وglw-c) سابقا5. أربعة ذكور heterozygous تحمل أليل البرية من نوع (+) وخروج المغلوب أليل GLW-cفي موقع GLWamide (النمط الجيني: +/glw-c)عبرت مع أنثى heterozygous تحمل أليل البرية وخروج المغلوب مختلفة allele gl...

والهدف من هذا البروتوكول هو النمط الجيني لداء النعمان البحر نيماتوستيلا vectensis أثناء التطفل دون التضحية بالجنين.

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

يمكّن هذا البروتوكول الباحث من تحديد النيمونات البحرية المتحولة أثناء تولد الأجنة المبكر بحيث يمكن تحليل النمط الظاهري التنموي بعد الجنين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لأسلوب الحياة البحرية الفردية في وقت مبكر من التناضح دون التضحية بحياة الحيوان. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون ميغيل سيلفا، وهو طالب دراسات عليا من مختبري.في اليوم السابق لتفريخ الحث ، ضع نزعة النعمة الخيطية في vectenella في حاضنة درجة الحرارة والضوء ، وبرمجة الحاضنة بحيث تتعرض الحيوانات لثماني ساعات من الضوء عند 25 درجة مئوية. في اليوم التالي، إزالة الحيوانات من الحاضنة وتركها على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة مع الضوء على للسماح بالتفريخ، والتي سوف تحدث في غضون ساعة ونصف إلى ساعتين التالية. استخدم ماصة نقل يتم قطع طرف لتكبير الفتحة لوضع حزم البويضات من حاوية الإناث إلى حاوية ذكور تحتوي على الحيوانات المنوية وتركها في حاوية الذكور لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح بالتخصيب.بعد الإخصاب ، إلى dejelly حزم البيض ، ووضعها في مياه البحر التي تحتوي على 3 ٪ السيستين على طبق بيتري الزجاج والتحريض بلطف على شاكر لمدة 12 دقيقة. ثم تفريق كتل مع ماصة بلاستيكية والاستمرار في التحريض لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق أخرى حتى dejellied تماما. الحفاظ على البيض المخصب على نفس الطبق في 16 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة.في اليوم التالي، قم بإعداد العازلة استخراج الحمض النووي كما هو موضح في المخطوطة، وخلط جيدا من قبل دوامة، و aliquot ذلك في أنابيب PCR عن طريق إضافة 20 ميكرولترات لكل أنبوب. تذوب 1٪ agarose في مياه البحر، وتصب في طبق بيتري لتغطية الجزء السفلي، وتبرد على أعلى مقاعد البدلاء لجعل سرير هلام. غطي سرير الجل بمياه البحر العذبة.نقل الأجنة ما بعد الإخصاب على مدار 24 ساعة باستخدام ماصة في طبق بيتري الذي يحتوي على هلام agarose. إدراج إبرة التنغستن في حامل الحاجة وتعقيم عن طريق غمس طرف في الكحول ووضعه في اللهب لحرق الكحول. تحت مجهر تشريح، وجعل الاكتئاب على agarose باستخدام إبرة التنغستن لإزالة قطعة من أغاروز السطح حول حجم الجنين ليتم التلاعب بها.ثم، باستخدام إبرة التنغستن، وضع الجنين في الاكتئاب مع الجانب الجانبي التي تواجه لأسفل من أجل تقييد حركة الجنين لجراحة الميكروستور. من أجل إجراء جراحة ناجحة ، من المهم تقييد حركة الجنين. مع إبرة التنغستن ، قم بإزالة قطعة من الأنسجة البورال جراحيًا على طول محور البورال الفموي ، وتقع مقابل فتحة blastoporal الفموية.مع ماصة P20، نقل الأنسجة المعزولة إلى أنبوب PCR تحتوي على 20 ميكرولترات من العازلة استخراج الحمض النووي. نقل الجنين بعد الجراحة إلى بئر من 24 بئر لوحة تحتوي على ما لا يقل عن 500 ميكرولترات من مياه البحر الطازجة. ووضع لوحة تحتوي على الأجنة بعد الجراحة في حاضنة في 16 درجة مئوية حتى يتم الانتهاء من جينوتوبينغ.لاستخراج الحمض النووي الجينومي من أجنة واحدة، تدور أولا لفترة وجيزة أسفل أنابيب PCR التي تحتوي على العازلة استخراج الحمض النووي والأنسجة الجنينية المعزولة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. ثم احتضان الأنابيب في 55 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات في حين دوامة لمدة 30 ثانية كل 30 دقيقة لضمان تفكك كتل الخلية وتعزيز تحلل الخلية. بعد تعطيل البروتينات K في 95 درجة مئوية لمدة أربع دقائق، وإعداد تفاعل PCR باستخدام الحمض النووي الجينوم المستخرج كقالب لتضخيم موضع الاهتمام.التصميم المطلوب التمهيدي كما هو موضح في المخطوطة. إعداد 20 ميكرولتر تفاعل PCR. بعد اكتمال PCR، تشغيل agarose هلام electrophoresis لتحديد حجم ووجود أو غياب منتجات PCR، مع التأكد من ضبط حالة agarose جل electrophoresis اعتمادا على الحجم المتوقع من منتجات PCR.استخدم نتائج PCR فيما يتعلق بالحجم والوجود أو الغياب أو منتجات PCR لتعيين نمط جيني لكل جنين بعد الجراحة ثم فرز الأجنة وفقًا للنمط الجيني الخاص بها. يحتوي جينوم نيماتوستيلا على موضع واحد يقوم بترميز بروتين السلائف لـ neuropeptide، GLWamide. ثلاثة أليل متحولة بالضربة القاضية في مركز الغفران تم الإبلاغ عنها سابقاًنتائج PCR من الأجنة عينة عشوائيا بين ذرية من الصليب F1 بين أنثى واحدة heterozygous تحمل أ أليل بالضربة القاضية والذكور heterozygous تحمل أليل C بالضربة القاضية تظهر أنواع جينية مختلفة. الأجنة واحد واثنين تظهر فرقة PCR واحدة المقابلة للحجم المتوقع من أ أليل بالضربة القاضية. الأجنة ثلاثة وستة تظهر اثنين من العصابات PCR مع الأحجام المتوقعة للضوضاء المغلوب أ وC.Embryos أربعة، سبعة، وثمانية تظهر فرقة PCR واحد المقابلة لحجم المتوقع من أليل خروج المغلوب C.يظهر الجنين 5 لا عصابات، مما يشير إلى عدم وجود ربط التمهيدي. لاستبعاد إمكانية فشل استخراج الحمض النووي الجينومي ، تم تشغيل PCR آخر باستخدام التمهيدي العكسي الذي يمكن أن يرتبط تسلسل نوع البرية. وفي حالة اكتشاف منتج من الـ PCR بحجم متوقع، كان استخراج الحمض النووي الجيني ناجحاً.في حين أن أي منتج يشير إلى فشل في الاستخراج. وعلى الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم لأجنة شقوق البحر، فمن المؤكد أنه من الممكن تطبيق هذه الطريقة على الـ cnidarians الآخرين، مثل الشعاب المرجانية وقناديل البحر، حيث يمكن الوصول إلى المعلومات الجينية والأجنة. بعد هذا الإجراء، يتم استخدام المسوخ المحددة لتقييم النمط الظاهري التنموي.على سبيل المثال، يمكن استخدام تقنيات الأنسجة مثل الكبت المناعي لتقييم العيوب في مورفولوجيا، في حين يمكن استخدام التهجين في الموقع، والتكرار الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR، و RNA-seq لتقييم العيوب في التعبير الجيني. كما يمكن استخدام التصوير الحي لتقييم العيوب في السلوك أثناء التطور الجنيني، كما هو الحال في اليرقات أو في الاورام الحميدة المبكرة.

genotyping-of-sea-anemone-during-early-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

حقن مكروي هو أسلوب شائع يستخدم لتقديم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير أو العلاجات الأخرى في البيض والأجنة، وخلايا الأنواع المختلفة.

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

وhawaiensis amphipod Parhyale هو كائن نموذج واعد للدراسات علم الأجنة القشريات والتنمية المفصلية المقارن والتطور. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإزالة دليل عن Blastomeres احد من بداية مرحلة الانقسام الأجنة من Parhyale.

الاجتثاث من خلية واحدة من خلايا الأجنة ثمانية من القشريات Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

الأساليب التي تنتج أجنة morphant ضرورية لدراسة آليات تنموية والشبكات التنظيمية الجينات. نجم البحر Patiria miniata هو نظام نموذجي الناشئة عن هذه الدراسات. هنا نقدم بروتوكول للحصول على الأمشاج، وتنتج ثقافات الأجنة، وحقن مكروي السريع للبيضات ملقحة من هذا النوع.

منهج في Microinjection من Patiria minata بيضات ملقحة

الهدف من هذا البروتوكول هو تزويد المستخدمين بمجموعة من الطرق لفك المركبات عالية الإنتاجية لأجنة Lymnaea stagnalis واليرقات استعدادا للتهجين الكامل في الموقع ، وللعلاجات اللاحقة قبل وبعد التهجين.

ككل جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; طريقة التهجين لالبطني الأقدام الرخويات<em&gt; الراكدة المنقعية</em

نوضح هنا كيفية تحفيز ومراقبة التجدد في شقائق النعمان البحرية النجمية Nematostella vectensis ، وهو نموذج أنثوزوان مجوف مجوف.  نوضح كيفية بتر وتصنيف التجديد باستخدام نظام التدريج المورفولوجي ، ونستخدم هذا النظام للكشف عن متطلبات الالتهام الذاتي في تجديد هياكل الاورام الحميدة.

حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم Nematostella vectensis

تفاصيل هذه المقالة الفيديو مباشرة في منهجية الجسم الحي والتي يمكن استخدامها لمنهجية وكفاءة تميز مكونات مسارات الإشارات المعقدة وشبكات تنظيمية في العديد من الأجنة اللافقاريات.

قوة البساطة: قنفذ البحر الأجنة كما<em&gt; في فيفو</em&gt; نماذج التنموية لدراسة مجمع خلية الى خلية اشارة شبكة التفاعلات

والهدف من هذا البروتوكول هو إجراء التهجين في الموقع على عينات المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. هذا أسلوب نوعية المستخدمة لتصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق معنى المضادة الحمض النووي الريبي في الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين.

في الموقع تقنيات التهجين لعينات المرجان الكبار جزءا لا يتجزأ من البارافين

ويتيح هذا البروتوكول التصور للتعبير الجيني في الجنينية أستياناكس كافيفيش. وقد وضعت هذا النهج مع الهدف المتمثل في تعظيم إشارة تعبير الجينات، مع التقليل من تلوين الخلفية غير محددة.

ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس

يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على مستخلص السم الخام من شقائق النعمان البحرية والكشف عن نشاطه الانحلالي والفوسفوليباز.

تحديد نشاط انحلال الدم والفوسفوليباز في المستخلصات الخام من شقائق النعمان البحرية عن طريق المقايسات الحيوية المباشرة

يتم تقديم مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين (X-ChIP) مقابل علامة الهستون H3K4me3 للكائن النموذجي Exaiptasia diaphana . يتم تأكيد خصوصية وفعالية الفحص من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتسلسل الجيل التالي. يتيح هذا البروتوكول زيادة التحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في شقائق النعمان البحرية E. diaphana.

الترسيب المناعي للكروماتين في نظام نموذج Cnidarian Exaiptasia diaphana

اكتشف تقنية الكتابة الجينية غير القاتلة لعنابة النعمان البحرية Nematostella vectensis خلال التنمية المبكرة. تتيح هذه الطريقة للباحثين تحديد الطفرات الوراثية دون إتلاف الأجنة، مما يُسهّل دراسة التطور بعد الجنين.

الكتابة الجينية لعنابة النعمان البحرية خلال التنمية المبكرة

استكشف المزيد من الفيديوهات