المصيدة الرقمية الحبريه (ddTRAP): تكييف بروتوكول تضخيم التيتيمير المكرر إلى التفاعل المتسلسل الرقمي لسلسله البلمره

يوفر مقايسة ddTRAP القدرة على الحصول على قياس حساس وقوي وكمي للغاية للنشاط الأنزيمي الذيلوميرازي في الخلايا. القدرة على تشغيل ما يصل إلى 96 عينات لكل تشغيل بطريقة متوسطة الإنتاجية يقدم لنا ميزة كبيرة. يمكننا تشغيل عناصر التحكم و نسخ متماثلة للتحليل الإحصائي السليم على البيانات التي تم جمعها.

مباشرة قبل lysing الخلية، ذوبان aliquot المجمدة من NP-40 تحلل العازلة. بمجرد إذابة، ضع عازلة التحلل على الجليد. إضافة مثبطات بروتياز PMSF إلى العازلة تحلل NP-40 للوصول إلى تركيز النهائي من 0.2 ملليمولار.

ثم، إضافة 40 ميكرولترات من العازلة تحلل إلى أنبوب يحتوي على بيليه خلية للوصول إلى معادلة الخلية من 25،000 خلية لكل ميكرولتر. بلطف ماصة وlysate صعودا وهبوطا من أجل كسر فتح الخلايا. في محاولة لتجنب صنع فقاعات.

السماح للخلايا لlyse على الجليد لمدة 30 دقيقة. دوامة بلطف lysate كل 10 دقائق لمنع مجموعات من حطام الخلية من تشكيل. أثناء تحلل الخلية ، قم بإعداد مزيج رئيسي في أنبوب microcentrifuge لرد فعل تمديد التيلوميراز ، وتخزينه على الجليد.

بعد تحلل الخلية، ماص 48 ميكرولترات من التمديد مزيج رئيسي في كل أنبوب PCR. إضافة اثنين من microliters من lysate المخفف إلى كل أنبوب PCR للوصول إلى معادلة الخلية النهائية من 50 خلية لكل ميكرولتر، ومواصلة رد فعل تمديد التيلوميراز وفقا للمخطوطة. إعداد مزيج رئيسي في أنبوب microcentrifuge لdDTRAP، والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة.

Pipette 19.8 ميكرولترات من مزيج سيد ddPCR في كل أنبوب PCR. إضافة 2.2 ميكرولترات من حل رد فعل التمديد السابق لكل أنبوب، وترك حجم إجمالي من 22 ميكرولترات. لإعداد خرطوشة توليد القطيرات، قم أولاً بتحميل 20 ميكرولترات من الحل المعد في العينة الوسطى بشكل جيد في الخراطيش.

اضغط بلطف على جانب الكارتريدج لنقل أي فقاعات إلى أعلى الحل. يجب تحميل جميع آبار الكارتريدج مع عينة قبل تحميل النفط. ثم، تحميل 70 ميكرولترات من النفط توليد قطرات في بئر النفط الأيسر.

تأمين طوقا في مكان عن طريق ربطه إلى نهايات خرطوشة، ووضع خرطوشة محملة وتجميعها في مولد قطرة. يظهر المولد الضوء الأخضر الصلب لإبلاغ الكارتريدج يتم وضعه بشكل صحيح. بعد 60 إلى 90 ثانية، عندما يتوقف ضوء مولد وامض، تكون الدورة كاملة.

الآن قم بإزالة الكارتريدج. قم بإزالة طوقا من الخراطيشة برفق. استخدام ماصة متعددة القنوات إلى ماصة ما يقرب من 40 ميكرولترات من قطرات ولدت حديثا من الحق في بئر إلى 96 جيدا PCR لوحة.

قم بختم لوحة مع رقائق الألومنيوم PCR لوحة الأختام مرة واحدة يتم تحميل جميع العينات في لوحة 96-جيدا لمنع التبخر. ثم، تحميل لوحة 96-جيدا في ثيرسيكلولر لأداء تفاعل PCR. للبدء ، قم بتحميل لوحة 96-well في قارئ القطرات.

توجيه لوحة بشكل صحيح بحيث يطابق نموذج A1 أن من حامل. افتح البرنامج المرتبط بقارئ القطرات. انقر نقرًا مزدوجًا فوق أول بئر ، A01 ، لفتح شاشة محرر العينة جيدًا.

انقر على التجربة، وحدد نوع الفحص الذي سيتم استخدامه من القائمة المنسدلة. حدد QX200 ddPCR EvaGreen Supermix كطريقة الكشف الصحيحة. انقر على تطبيق في الجانب الأيسر السفلي من شاشة محرر البئر لحفظ الإعدادات المعرفة من قبل المستخدم في جميع الآبار المميزة.

بعد ذلك، انقر فوق الهدف في شاشة محرر البئر، وانقر على القائمة المنسدلة الهدف لتحديد عنصر تحكم غير معروف أو مرجع أو عدم وجود قالب لتحديد نوع العينة. في المقطع اسم العينة تسمية كافة النماذج ثم انقر فوق تطبيق. انقر فوق تشغيل لقراءة اللوحة.

حدد إما أعمدة أو صفوف في شاشة خيارات التشغيل عند مطالبتك بإعلامك حول الاتجاه الذي يجب أن تقرأ فيه اللوحة. تحديد عدد القطرات المقبولة لكل عينة بالنقر المزدوج على الآبار الفردية أو رؤوس الأعمدة والصف لتوفير جدول معلومات. بالنسبة لـ ddTRAP، فإن العينات التي بها 10000 قطرة مقبولة أو أكثر صالحة لمزيد من التحليل.

تسليط الضوء على الآبار التي تمثل نماذج مكررة وعينات المجلس الوطني الانتقالي. تعيين عتبة يدوياً للعينات بالنقر على رمز لتعيين عتبات على أسفل يسار الشاشة. في هذا البروتوكول، تم قياس نشاط التيلوميراز في لوحة الخلايا التي تتكون من تسعة خطوط الخلايا من سرطان الرئة والتيلوميراز السلبية الخلايا الليفية.

تم تعيين عتبة في حوالي 2،000 سعة الفلورنس لجميع النسخ البيولوجية الثلاثة لSHP77، H2887، NTC. وكان قطرات إيجابية كثافة الفلوريسين حول 6،000 السعة الفلورية، والتي شكلت سكاناً واضحة في الجزء العلوي، وفصلت عن قطرات سلبية حوالي 1، 100 السعة الفلورية. تم تقدير مجموع منتجات تمديد التيلوميراز لكل مكافئ خلية بين جميع العينات من التركيز المقاس للأحماض النووية، والذي يمثل نشاط التيلوميراز في خطوط سرطان الرئة.

أي تلوث RNase أثناء خطوات تفاعل التحلل أو التمديد سوف تدمر التيلوميراز النشاط الأنزيمي لأنه مركب ribonucleoprotein. ddTRAP يمكن أن يتبع مع ddPCR على مستويات التعبير hTERT مرنا في الخلية. وتتيح لنا مجموعتان من البيانات ربط تعبير hterT بنشاط التيلوميراز والتعمق في الآليات التنظيمية المحتملة التيلوميرازية مثل الربط البديل.

يمكننا استكشاف التلاعب بعوامل الربط محددة وآثارها على نشاط التيلوميراز. حاليا، ونحن على تصميم oligonucleotide التضمينات والعقاقير المحتملة التيلوميراز النشاط.