استهداف المجاميع ألفا سينوكلين في ألياف الأعصاب الطرفية الجلدية عن طريق اختبار المناعة العائمة الحرة

تشخيص مرض باركنسون لا يزال يعتمد على العلامات السريرية للمشاركة الحركية التي تظهر في وقت لاحق في سياق المرض، عندما يتم فقدان معظم الخلايا العصبية من النيجرا substantia بالفعل. يسمح هذا البروتوكول بتحليل الأعصاب الجلدية عن طريق خزعة الجلد ، التي تمثل علامة حيوية جديدة محتملة للمرض ، لاستخدامها في التجارب السريرية. خزعة الجلد هو إجراء يمكن تقييمه بسهولة ، وليس الغازية التي تسمح لتحليل الأنسجة العصبية الطرفية التي هي عرضة لعلم الأمراض.

ألفا synuclein المجاميع الكشف عن طريق خزعة الجلد يمكن استخدامها لأغراض التشخيص، وربما في المراحل المبكرة، عندما يكون العلاج المحتمل الأكثر فعالية. متابعة خزعات الجلد في نفس المريض تسمح الوقت وتحليل دورة خاصة من ألفا synuclein المجموع انتشار في الجهاز العصبي الجلدي البشري. ويمكن لهذه أن تلقي الضوء على التسبب في المرض.

لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد حل تثبيت PLP جديد كما هو موضح في جدول واحد من بروتوكول النص. مباشرة بعد جمع خزعة الجلد، غمره في أنبوب يحتوي على 10 ملليلتر من الحل المثبت. احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي، في غطاء الدخان، وإزالة تثبيت PLP بلطف. في نفس الأنبوب، اغسل الخزعة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من هذه الدقائق، باستخدام خمسة ملليلترات من محلول سورنسن الزنجي 0.1 لكل غسل. تجاهل حل سورنسن، وإضافة خمسة ملليلترات من محلول الحماية المبردة.

احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، تخزين خزعة في أربع درجات مئوية إذا كان خفض مع cryotome هو أن يتم تنفيذها في غضون أسبوع واحد. أولاً، تعيين cryotome إلى ناقص 20 درجة مئوية.

خذ cry وملء مع وسيلة تضمين التبريد. باستخدام الملاقط، غمر الخزعة في الوسط المضمّن للتبريد، مع المحور الطولي الموازي لقاع الـ cryomold. اابكي تجميد العينة مع النيتروجين السائل، للحصول على مكعب صلب من المبرد-تضمين المتوسطة التي تحتوي على خزعة في الاتجاه الصحيح.

ضع العينة في الكواد، وانتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للخزعة بالتأقلم. ثم، إصلاح العينة على التبريد ومقطعة إلى أقسام 50 ميكرومتر. باستخدام فرشاة صغيرة، نقل المقاطع المبردة إلى لوحة 96-well تحتوي على 200 ميكرولترات من محلول التجمد في كل بئر.

بعد هذا، تخزين لوحة في ناقص 20 درجة مئوية. للبدء، وملء بعض الآبار من لوحة 96-well الطازجة مع 100 ميكرولترات من محلول الغسيل. نقل الأقسام لتحليلها من لوحة التخزين إلى الجزء الذي يحتوي على محلول الغسيل.

اترك الأجزاء في محلول الغسيل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، نقل كل قسم إلى بئر فارغة تحتوي على نفس محلول الغسيل، وكرر الغسيل. بعد ذلك، إضافة محلول الغسيل إلى الأقسام، ونقلها إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولترات من محلول الحجب.

احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة على الأقل، والحد الأقصى من أربع ساعات. تمييع الأجسام المضادة الأولية، المضادة PGP9.5 ومكافحة 5G4، في حل العمل. نقل المقاطع إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولترات من حل العمل للأجسام المضادة الأولية، واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.

في اليوم التالي، قم بغسل الأجزاء في الآبار التي تحتوي على محلول الغسيل كما سبق وصفه. تمييع الأجسام المضادة الثانوية، الماعز المضادة الأرنب للكشف عن PGP9.5، والماعز المضادة للماوس للكشف عن 5G4، في حل العمل. نقل الأجزاء المغسولة إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولترات من حل العمل للأجسام المضادة الثانوية.

غطي الطبق برقائق الألومنيوم لتجنب تبييض الفلوروفور المقترن بالأجسام المضادة الثانوية، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. بعد ذلك، غسل الأقسام مرتين في محلول الغسيل كما هو موضح سابقا. نقل الأجزاء المغسولة إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولترات من DAPI لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الأقسام مرتين في محلول الغسيل كما هو موضح مسبقًا. ثم قم بتحميل المقاطع على شريحة في الموضع الصحيح، وتجنب misfolding. إضافة بضع قطرات من متوسطة التركيب إلى الشريحة وتغطية القسم مع زلة غطاء.

دع الشرائح تجف بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بتخزين الشرائح في مربع مناسب عند أربع درجات مئوية، مع التأكد من تجنب التعرض للضوء. باستخدام مجهر الفلورانس المقلوب أو مجهر confocal، عرض المقاطع.

الحصول على الصور بواسطة كاميرا متصلة المجهر. ثم استخدم مجهر الفلوريسنس أو مجهراً مُتطابقاً لتحليل الإشارات الإيجابية في الأقسام من حيث التوزيع المكاني وشدة الإشارة كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد الطريقة الموصوفة، يتم الكشف عن مجاميع ألفا synuclein المسمى مع الأجسام المضادة 5G4 في ملزمات العصب الجلدي الهياكل الذاتية من المرضى PD.

مورفولوجيا رواسب ألفا سينوكلين يظهر كإشارة منقط على طول محاور الأعصاب الجلدية. الاستخدام التمثيلي لهذا البروتوكول في 19 PD المرضى و 17 ضوابط في خزعات الجلد في ثلاثة مواقع التشريحية يبين أن 5G4 لديه حساسية من 81٪ وخصوصية 86٪ بالمقارنة مع الضوابط الصحية. الفوسفور ألفا synuclein لديه حساسية من 56٪، وخصوصية 100٪ 5G4 وتوجد الودائع ألفا سينوكلين الإيجابية الفوسفورية أساسا حول الغدد العرقية, ولكن توجد أيضا في العضلات arrector بيلي, السفن الصغيرة, والزفير الجلدي ودون رقبة, ولكن أبدا في الألياف العصبية داخل المدى.

عموما، داخل الغدد العرقية تجويف، فمن الممكن لمراقبة إشارة غير محددة التي يمكن أن يساء تفسيرها كما 5G4 أو فوسفورية ألفا سينوكلين الإيجابية. هذا النوع من الإشارة منقط، كروية، ويرجع ذلك على الأرجح إلى المواد الفلورية الذاتية داخل الأرصاد كما هو موضح في الضوابط التقنية دون الأجسام المضادة الأولية والثانوية. التكلس مع PGP9.5 الذي يصادف الألياف العصبية، والتي هي شكلية خيوط وممدود، يساعد على تحديد الإشارة الصحيحة.

لذلك، يتم زيادة خصوصية إشارة 5G4 بشكل كبير من خلال مضاعفة المناعة مع علامة محور عصبي. تثبيت دقيقة من الخزعة ضروري لإنتاج تلطيخ مناعي ذات نوعية جيدة وللتفسير الموثوق به من الإشارات الفلورية. إذا لم يتم إعداد المثبت بشكل صحيح، أو إذا حدث الإفراط في التثبيت، ستكون النتيجة ذاتية الفلوروس عالية من شأنها أن تخفي إشارة الألياف العصبية عبور تقاطع الجلد الجلدي، أو innervate الهياكل الجلدية الرئيسية.

الخطوة الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو تثبيت الأنسجة. انتبه إلى pH من حل PLP المثبت، وتوقيت الحضانة، لتجنب الفلوروس وإشارة محددة.