نظام دقيق لإيصال مسببات الأمراض واستعادتها لنماذج المورين من الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي

الهدف العام لهذا الإجراء هو تعزيز الدراسات الثانوية الالتهاب الرئوي البكتيرية من خلال توفير طريق بسيط وغير باضع للتطعيم البكتيري في الجهاز التنفسي السفلي متبوعاً بالانتعاش البكتيري وتنقية الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ. وسيتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير عميق لأول مرة الماوس وإدراج إبرة عازمة حادة الرأس مسبقة في القصبة الهوائية من الماوس الذي تم تعليقه عموديا من القناين الفك العلوي. ثانياً، بعد نجاح العدوى، يتم استرداد وحدات تكوين القولون البكتيري عن طريق الختان وتجانس الرئتين.

يتم تخفيف التجانس الرئة الناتجة بشكل متسلسل ومطلي على أجار المغذيات لتعداد وحدات تشكيل المستعمرة. وأخيرا، يتم تنقية الحمض النووي الريبي من التجانس الرئة. مزايا هذا الإجراء هو أنه يتيح التسليم المراقب مباشرة في الجهاز التنفسي السفلي.

وهذا يمكننا من النظر في كل من المساهمات الجمعية والفردية للممرض في تحقيق نتيجة المرض. وقد أظهرت التطورات الأخيرة في هذا المجال أن تنظيم الجينات البكتيرية قد يكون له دور كبير في تحديد نتيجة العدوى. هذه التقنية تستفيد من القدرة على استعادة كل من البكتيريا CFUs ومن ثم RNA.

مرة واحدة يتم عزل الجيش الملكي النيبالي، يمكننا بعد ذلك تقييم مساهمات جينات الفوعة محددة نحو العدوى. بالإضافة إلى ذلك ، تستفيد هذه التقنية من كونها غير اغرجية. وهذا يسمح للحد الأدنى من الإجهاد أن توضع على أي الحيوانات المستخدمة في هذا الإجراء، وتمكنهم من الحصول على الانتعاش الفوري.

يستفيد هذا الإجراء من استخدام معدات المختبرات المشتركة دون استخدام أي نوع من القنّيات أو أسلاك الإرشاد أو كابلات الألياف البصرية. الأفراد الجدد لهذه التقنية قد النضال في البداية مع التثبيت الفعلي من خلال القصبة الهوائية. بمجرد أن يتم تصور هذه التقنية ، يصبح إجراءً بسيطًا وفعالًا لاستجواب الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي داخل مضيف المورين.

قبل البدء في الإجراء، وإعداد مساحة العمل مع اللوازم التالية: منصة الاحتضان، ومعقم حقنة mL واحد، ملقط حادة حادة معقم، معقمة 21 قياس إبرة حادة الرؤوس، واثنين من أنابيب مخروطية لتخزين الحقنة والملتحم. ابدأ الإجراء من خلال إعداد الإمراض بحيث يتم الحصول على التركيز النهائي المرغوب في حجم 50 ميكرولتر. بعد ذلك، باستخدام قفازات معقمة إعداد واحد إلى 1.5 بوصة 21 قياس إبرة حادة الرؤوس عن طريق الانحناء إلى زاوية 35 درجة تقريبا.

بعد تثبيت الإبرة إلى الحقنة ، ارسم وسادة هوائية 100 ميكرولتر ، تليها 50 ميكرولترات من العامل المعدي. وسادة الهواء 100 ميكرولتر يضمن التسليم الكامل لتحميل مسببات الأمراض مرة واحدة في حقنة هو الاكتئاب. ضع الإبرة المحمّلة والمحاقن في موقع يسهل الوصول إليه من قبل اليد المهيمنة.

إزالة وتخدير الماوس من غرفة التخدير وتعليق الماوس على منصة الاحتضان من شالات الفك العلوي. باستخدام ملقط حادة الرؤوس، فهم بلطف وتمديد اللسان. نقل اللسان من ملقط في الإبهام وسببة اليد غير الميدية.

تبقى عقد اللسان في اليد غير المهينة والتقاط الحقنة مسبقة التحميل. نقطة نهاية عازمة من إبرة بعيدا عن الجسم. أدخل الإبرة في تجويف الفم.

في قاعدة اللسان برفق زاوية المعصم للتسبب في دفعة طفيفة من إبرة بعيدا عن الجسم. يضمن هذا الإجراء إدخال الإبرة في القصبة الهوائية وليس في المريء. توجيه ببطء الإبرة إلى أسفل إلى القصبة الهوائية.

في كثير من الأحيان يشعر القراد طفيف كما يمر الإبرة من خلال أضعاف الصوتية. تمرير الإبرة من خلال القصبة الهوائية حتى يشعر مقاومة طفيفة كما تواجه الإبرة carina. ارفع الإبرة قليلاً في الاتجاه التصاعدي لتعليق الإبرة فوق carina.

وهذا يتيح التسليم في الشعب الهوائية الأولية. اكتئب تماما المكبس حقنة لتسليم الحمل المعدية. إزالة الإبرة من القصبة الهوائية والتخلص.

إزالة الماوس من منصة الاحتضان عن طريق الاكتئاب الشريط المطاطي، ولكن الحفاظ على عقد الماوس في وضع مستقيم. عرقلة مجرى الهواء الأنفي عن طريق وضع إصبع مباشرة على nares. عقد هذا الموقف لمدة دقيقة واحدة تقريبا أو حتى يتم مراعاة العديد من الأنفاس العميقة.

هذه الخطوة الأخيرة تضمن أن يتم تسليم إجمالي حجم inoculum في الجهاز التنفسي السفلي. إعادة الحيوان إلى قفصه وضمان وجود انتعاش سريع من التخدير. في نقاط زمنية مختارة بعد الإصابة بالعدوى يمكن استئصال الرئتين المصابة لتحديد وتقييم المساهمات البكتيرية في زيادة المراضة المرتبطة بالالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي.

إعداد مساحة العمل مع العناصر التالية: مقياس وقارب يزن العقيمة، ومنصة تشريح، مجموعة تشريح تحتوي على مقص وقطط، والشاش العقيم. لأغراض هذه المظاهرة سيتم تنفيذ استئصال الرئتين على أعلى مقاعد البدلاء. ومع ذلك، من أجل الحفاظ على العقم طوال هذا الإجراء فمن المستحسن أن يتم إجراء ختان الرئة داخل غطاء تدفق الفاتن.

القتل الرحيم فأر مصاب مع CO2 أو ما شابه ذلك IACUC طريقة وافقت القتل الرحيم. وضع وتأمين الماوس المصابة على منصة تشريح. رش الماوس بالإيثانول للحفاظ على العقم على أسطح العمل.

بداية من أومبيليكوس، استخدم ملقط الزوج لرفع الجلد وجعل شق نحو الحنجرة. الامساك بالبشرة على جانبي الشق الأولي، وسحب الجلد بعيدا عن الجسم وقطع من خلال اتصالات الأنسجة. قد يكون من المفيد إجراء تخفيضات على الجلد من الجانب الجانبي للكشف عن المزيد من المنطقة الصدرية.

بدءا من قاعدة عملية xiphoid ، وجعل شق صغير بقصد ثقب الحجاب الحاجز. وهذا يؤدي إلى زيادة في الضغط في تجويف الصدر مما تسبب في الرئتين إلى التراجع. مع تراجع الرئتين، مواصلة شق لتحرير الحجاب الحاجز.

إزالة الأضلاع عن طريق إجراء شق على جانبي. هذا سوف يعرض تجويف الصدر والرئتين. لإخراج الرئتين فهم قاعدة القلب مع ملقط ورفع إلى أعلى.

ضع المقص خلف الرئتين وابدأ في إجراء شقوق صغيرة من خلال توصيلات الأنسجة مع الاستمرار في رفع القلب إلى الأعلى. بمجرد استئصال الرئتين ، ضعها على شاش معقمة وإزالة القلب عن طريق رفعه بعيدًا عن الرئتين وقطع اتصالات الأنسجة المتبقية. نقل الرئتين إلى قارب ما قبل tared تزن وتسجيل الكتلة.

بعد أن يتم وزن الرئتين، قم بنقل الرئتين إلى ملح معقم مُخزن بالفوسفات وتخزينهما مؤقتًا على الجليد. الآن بعد أن تم استئصال الرئتين ووزنها ، يمكن استرداد البكتيريا لتحديد دورها في التسبب في الأمراض. استعدادا لاستعادة البكتيريا، وسوف تكون هناك حاجة إلى الإمدادات التالية: طاحونة الأنسجة، معقمة RNase خالية من برنامج تلفزيوني، RLT العازلة تكمل مع بيتا-mercaptoethanol، و 1.5 مل RNase خالية أنابيب microcentrifuge.

تبدأ بإضافة أول مل واحد من برنامج تلفزيوني معقمة خالية من RNase إلى طاحونة الأنسجة. بمجرد ملئها، قم بتخزين طاحونة الأنسجة على الجليد. بعد ذلك، قم بإعداد سلسلة من أنابيب التخفيف التسلسلية الخالية من RNase لتحديد الحمل البكتيري الذي تم استرداده من الرئتين المصابين.

نقل الرئتين إلى طاحونة الأنسجة المعدة وتجانس الأنسجة جيدا عن طريق الضغط على أسفل على العلَم أثناء الدوران. فتح طاحونة الأنسجة و aliquot 100 ميكرولترات من العينة المتجانسة في أول من أنابيب التخفيف المسلسل المعدة. بشكل متسلسل تمييع العينات وطبقة على أجار المغذيات لتعداد وحدات تشكيل مستعمرة.

يمكن تسجيل وحدات CFUs كـ CFUs لكل مل أو وحدات CFUs لكل مل، لكل ملليغرام من أنسجة الرئة. بعد إزالة 100 ميكرولتر أليكوت، استبدال قاعدة الطحن والطرد المركزي العينة في 4، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. عندما يكون الطرد المركزي كاملاً، قم بإزالة المُنْتَرَح من العينة المُبَدَّة.

ويمكن حفظ ناظر وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية لمزيد من التحليل في وقت لاحق. إعادة تعليق بيليه الأنسجة المجانسة في 700 ميكرولترات من RLT بيتا-mercaptoethanol ونقل العينة إلى أنبوب RNase خالية من RNase 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي. عند هذه النقطة يمكن تخزين العينة في ناقص 80 درجة.

يمكن تنقية الحمض النووي الريبي من الطين الرئة RLT المتجانسة عن طريق تحميل العينة في أنبوب mL microcentrifuge تحتوي على حبات السيليكا 1 ملليمتر ومعالجتها عن طريق مضرب حبة لمدة 20 ثانية في ستة أمتار في الثانية الواحدة. ثم يتم تنقية الحمض النووي الريبي على الفور باستخدام التكيف من طريقة RNeasy كما ذكرت في Voyich، وآخرون. طرق في البيولوجيا الجزيئية"2008، ووصفها في المخطوطة المصاحبة لهذا الفيديو.

وبعد التنقية، يمكن قياس العائد من الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيفي. مرة واحدة كميا، فمن المفيد لتمييع الحمض النووي الريبي الناتجة إلى عدة aliquots من 50 نانوغرام لكل ميكرولتر. وهذا يمكّن الجيش الملكي النيبالي من العينة لاستخدامها في تحليلات متعددة دون أن تخضع لدورات ذوبان التجميد المتعددة.

استخدام هذه التقنية تمكن من تركيب تحميل الممرض الخاضعة للرقابة مباشرة في الجهاز التنفسي السفلي. ويمكن إثبات كفاءة هذا النظام التسليم من خلال تركيب 1٪ Coomassie حل الأزرق الرائعة. يعرض الصف العلوي زوجًا من الرئتين غير المصابة ليكون بمثابة عنصر تحكم ، بينما يعرض الصف السفلي زوجًا من الرئتين التي تلقت 50 ميكرولترات من صبغة زرقاء رائعة بنسبة 1٪Coomassie من خلال تركيب داخل منطقة العرض.

استخدام هذه الصبغة يوضح كيف يوفر تركيب داخل منطقة الجراة توزيعاً متكافئاً لتحميل الممرض في الرئتين اليمنى واليسرى. وبمجرد الإصابة، يمكن استعادة الحمل الممرض وتحليله في نقاط زمنية مختلفة بعد التثبيت داخل المختبرات عن طريق الختان وتجانس أنسجة الرئة. لإثبات كفاءة هذه التقنية الانتعاش اثنين من المجموعات التي تحتوي على ثلاثة فئران كل أصيب بجرعة منخفضة وعالية من المكورات العنقودية أوريوس.

تم مطلية المدخلات البكتيرية على أجار المغذيات لتعداد CFUs. بعد ساعة واحدة من التثبيت داخل المنطقة، تم قتل الفئران، تم استئصال الرئتين ومتجانسة في طاحونة الأنسجة. تم تخفيف الأنسجة المتجانسة بشكل متسلسل ومطلية على أجار المغذيات لتعداد وحدات CFUs.

يمكن فحص الحمض النووي الريبي المعزول عن أنسجة الرئة المتجانسة عن طريق النسخ العكسي PCR واستخدامها لتحديد كمية وفرة النصوص النسبية للجينات المستهدفة. لضمان الحد الأدنى من تلوث الحمض النووي الخلفية يوصى بأن يتم تشغيل تفاعل PCR ، دون إضافة نسخة عكسية ، إلى جانب أي تفاعلات qRT-PCR. بالإضافة إلى الأحمال البكتيرية ، يمكن توسيع هذه التقنية إلى تركيب وعزل الأحمال الفيروسية.

بعد تجانس أنسجة الرئة، يمكن عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي واستخدامه لقياس وفرة النصوص من الجينات الفيروسية أو بناء منحنى قياسي للكمية الفيروسية. استخدام هذا النظام يوفر نظام فعال للغاية وقابلة للتكرار لدراسة الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي. بمجرد اتقان، يمكن استخدام هذا الإجراء في تجارب واسعة النطاق.

العمل على دفعات للقتل الرحيم الفئران، يمكن أن يحدث التثبيت داخل المنطقة في غضون 30 ثانية لكل فأرة. بعد الانتهاء من ذلك ، والانتقال إلى استئصال الرئتين ، يمكن الانتهاء من ذلك في ما يقرب من دقيقتين إلى ثلاث دقائق لكل فأرة. في حين أن الأساليب التي نوقشت هنا كانت في سياق عدوى بكتيرية ثانوية، يمكن توسيعها نحو أي إجراء حيث يكون من الضروري إجراء عملية تسليم واسترجاع متحكمين في التلقيح.

بالإضافة إلى الطرق المذكورة هنا ، يمكن استكمال هذا الإجراء بإضافة لامهافة القصبات قبل استئصال الرئتين. في حين أن هذا غالبا ما يؤدي إلى انخفاض الانتعاش من الحمل الممرض، فإنه يستفيد من الحصول على البيانات، مثل تحليل السيتوكين، لاكتات dehydrogenase النشاط، وتحديد مجموعات الخلايا المختلفة. للحصول على فهم أكثر اكتمالا للأمراض المرضية يصبح من المهم استجواب كل من المضيف ومساهمة الممرضين في المرض.

كان الغرض من هذا الفيديو هو توفير طريقة بسيطة وفعالة لاستكشاف الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي داخل مضيف المورين.