إثراء جزيئات البروتين الدهني الأصلي مع ميكرورنا والتحديد اللاحق لمحتوياتها المطلقة/النسبية ميكرورنا ومعدل نقلها الخلوي

جسيمات البروتين الدهني هي مركبات النقل المحلية. وييسر تخصيب المواد الأجنبية استخدامها كناقل مسار. وضع علامات محددة من الجزيئات أو الجسيمات كلها يجعل من الممكن قياس امتصاص الخلوية.

طريقتان للإثراء سريعة وسهلة الاستخدام، ويمكن تكييفها لمجموعة واسعة من المواد. إثبات الإجراء سيكون ماركوس أكسمان و أندرياس كارنر، وهما بعد الدوّات من مختبري. لبدء delipidation في غطاء الدخان، مزيج من 1 إلى 2 ملليلتر من حل HDL المعدة التي تحتوي على خمسة ملليغرام من جزيئات HDL مع 50 ملليلتر من قبل تبريد ثلاثة إلى اثنين خليط من الإثير الإيثانول ديثيل في أنبوب الطرد المركزي مخروطي.

احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 2500 مرات ز لمدة 10 دقائق في درجة مئوية سلبية 10. تجاهل supernatant، resuspend بيليه في 50 ملليلتر من قبل تبريد الإيثانول ديثيل الأثير خليط، ودوامة لفترة وجيزة.

احتضان للمرة الثانية لمدة ساعتين في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 2500 مرة ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة سالبة 10 مئوية. ثم إدراج الأنابيب توريد تدفق غاز النيتروجين لتجفيف بيليه.

و resuspend في 250 ميكرولترات من العازلة A.Determine تركيز البروتين باستخدام تحليل البروتين برادفورد أو آخر واحد مناسب. ومن الأهمية بمكان إزالة أي بقايا من خليط الإثير الإيثانول، لأن هذه المذيبات من شأنها أن تمنع إعادة استعمال البروتينات الإبوليسية. بعد ذلك ، تمييع إلى تركيز نهائي من ملليغرام واحد من البروتين لكل 250 ميكرولترات من المخزن المؤقت A.Insert a.Insert أنبوب توريد الغاز الخامل في جزء الحل في الأنبوب.

إذا لزم الأمر، قم بتخزين المحلل بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية تحت الغلاف الجوي للغاز الخامل. لبدء إعادة تشكيل، في أنبوب زجاجي نظيف، مزيج 100 ميكرولترات من CO، 13.5 ميكرولترات من C، و 500 ميكرولترات من أجهزة الكمبيوتر. ثم تدوير أنبوب زجاجي في حين طرد غاز النيتروجين داخل الأنبوب لتجفيف الخليط من أجل إنتاج طبقة سطحية متجانسة. في أنبوب تفاعل 0.5 ملليلتر ، قم بإعداد محلول منوي جديد 30 ملليمولر في المخزن المؤقت A.Then مزيج 100 ميكرولتر من 10 ميكرولار الاصطناعية الحمض النووي الريبي مع 100 ميكرولترات من الحل المنوي في أنبوب تفاعل ميليلتر اثنين.

واحتضان لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية. بعد ذلك، نقل المحتضنة 200-microliter حل في أنبوب زجاجي لإعادة الترطيب على استعداد PC-CO-C mastermix طبقة السطح. ثم إضافة 50 ميكرولترات من محلول ديوكسيكولات الصوديوم 30 ملليغرام لكل ملليلتر.

يُحرّك المزيج عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك، إضافة 250 ميكرولترات من حل HDL delipidated في أنبوب زجاجي. ويحرك عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

لبدء غسيل الكلى، أولا إضافة 50 غراما من الخرز الماص إلى 800 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة. واستخدمي مُحرك مغناطيسياً ليُحرّك لمدة دقيقة واحدة. انتظر 15 دقيقة للخرز لتسوية، وdedeant فائقة.

كرر الإجراء مع برنامج تلفزيوني مبرد مسبقاً. أشرطة غسيل الكلى قبل الرطب في برنامج تلفزيوني. استخدام حقنة لإضافة الخليط المعد مسبقا في الكاسيت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

إضافة الخرز الممزخرة التي يعامل برنامج تلفزيوني إلى ثلاثة لترات من برنامج تلفزيوني، ووضع أشرطة في برنامج تلفزيوني لsededyze في أربع درجات مئوية. تبقي الخرز تدرج الكثافة على طول غشاء غسيل الكلى ثابت. تغيير المخزن المؤقت والخرز بعد ساعة وساعتين.

بعد 24 ساعة، مع حقنة، استخراج الحل من الكاسيت في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر لاستعادة حل الجسيمات HDL المعاد تشكيلها. تحديد تركيز البروتين باستخدام فحص برادفورد. توريد الغاز الخامل إلى أنبوب التفاعل، وختم عليه، وتخزين حل الجسيمات HDL المعاد تشكيلها تحت الغلاف الجوي الغاز الخامل في أربع درجات مئوية.

أولاً، أعد محلول حني حيواني 30 ميلي ميل في الماء الخالي من الرناز. مزيج 100 ميكرولترات من 10 ميكرومولار من الحمض النووي الصغير الاصطناعية مع 100 ميكرولترات من حل الحيوانات المنوية في أنبوب تفاعل ملليلتر اثنين. واحتضان لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية.

ثم إضافة 100 ميكرولترات من DMSO و 1.2 ملليلتر من 1X LDL العازلة لمحلول الحيوانات المنوية microRNA المعدة. تمييع محلول جسيمات LDL المعدة مسبقًا مع PBS إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي أربعة ملليجرامات لكل ملليلتر. ثم رسم 450 ميكرولترات من الحل المخفف في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر، ومزيج مع 50 ميكرولترات من 10X LDL العازلة.

احتضانه لمدة 10 دقائق على الجليد. بعد الحضانة، والجمع بين 500 ميكرولتر حل الجسيمات LDL و1.5 ملليلتر ميكرورنا-الحيوانات المنوية-DMSO، واحتضانه لمدة ساعتين في 40 درجة مئوية. قم بإجراء غسيل الكلى على غرار ما سبق وصفه، وتخزين محلول الجسيمات LDL المسمى تحت غلاف الغاز الخامل عند أربع درجات مئوية.

للبدء، تمييع محلول جسيمات HDL أو LDL في PBS بين واحد إلى 100 و واحد إلى 1، 000. كليف ميكا عن طريق الضغط على شريط لاصق ضد الركيزة الميكا، وسحب الشريط قبالة لإزالة طبقات الميكا العليا. استخدام ماصة لإيداع اثنين من microliters على الميكا مشقوق حديثا لاحتضان لمدة خمس دقائق.

تميل جزيئات البروتين الدهني إلى تشكيل أغشية رابطة مستمرة على الأسطح. وبالتالي، من المهم ضبط تركيز الجسيمات على سطح الميكا للحصول على تلك الفردية. بعد الحضانة، شطف العينة مع برنامج تلفزيوني.

املأ الخلية السائلة عالية السرعة AFM مع برنامج تلفزيوني، واحمل الماسح الضوئي الحامل للميكا إلى مرحلة AFM عالية السرعة. في برامج التحكم، بدء عملية نهج من cantilever إلى سطح الميكا. استخدم أحجام المسح الضوئي أقل من ميكرومتر مربع واحد، وإبقاء قوى التصوير منخفضة قدر الإمكان.

صورة العينة في وضع التنصت. قم بتحميل البيانات في Gwyddion، والكشف عن الجسيمات عبر الحبوب علامة بواسطة الدالة عتبة. اضبط قيمة عتبة الارتفاع لإخفاء الجسيمات الفردية.

عادة، مستوى حوالي 50٪هو نقطة انطلاق جيدة. إزالة الخلفية متعددة الحدود لتسطيح الصورة، وتنشيط استبعاد منطقة ملثمة الخيار. تصدير قيم الارتفاع القصوى للجسيمات المكتشفة باستخدام توزيع مختلف خصائص الحبوب وظيفة، وتكرار هذه الخطوات لجميع الصور المسجلة.

وفي هذه التجربة، تم إعادة تشكيل جسيمات HDL من خلال إزالة الجزيئات من الجزيئات الحميدة، ثم إعادة الغسل الكلوي. ويمكن تحقيق غلة 50٪ من جسيمات HDL المعاد تشكيلها. ومع ذلك، لم يكن وضع العلامات نفسها مع ميكرورنا ممكنا لوضع العلامات على جزيئات LDL، وذلك بسبب الرهاب المائي للبروتين Apolipoprotein B100.

وهكذا، تم استخدام DMSO لاختراق أحادية الدهون من جزيئات LDL، مع العائد على ما يقرب من 100٪ أثناء مراقبة الجودة، وتخفيف أمر بالغ الأهمية للتحليل. الصورة العلوية تُظهر كثافة جسيمات عالية جداً. الصورة السفلية مناسبة للتحليل.

تم حساب وظائف كثافة الاحتمالية لارتفاعات الجسيمات للمقارنة بين توزيعات الحجم لجسيمات البروتين الدهني الأصلية، المسماة، والسيطرة عليها. التغيير النسبي قبل وبعد إجراء وضع العلامات مهمل. عند التعامل مع الحمض النووي الريبي oligonucleotides، والعمل RNAse خالية.

استخدام المواد الاستهلاكية البلاستيكية الطازجة المتاح، وارتداء دائما قفازات. استخدم فقط الحلول الخالية من النوى. AFM عالية السرعة هو مجرد طريقة واحدة لتحديد الشكل العام للبروتينات الدهنية.

وهناك طريقة بديلة هي المجهر الإلكتروني. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، والعمل في غطاء محرك الدخان أثناء التعامل مع الإثير ديثيل.