Name: حركه إطلاق النار من الراسم CFDA المحملة في الانسجه بالوعة القاع من Arabidopsis (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: اكتشف تحميل CFDA في جذور وسويقات Arabidopsis لدراسة النقل الخلوي بين الخلايا النباتية. يُظهر هذا البروتوكول كفاءة طرق التحميل المختلفة في تصور حركة المسبار الضوئي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671257) ومركز هوبي للابتكار التعاوني لصناعه الحبوب (LXT-16-18).

1. Arabidopsis النمو الراسي في MS المتوسطة
<ol><li>الداخلية من خزانه تدفق الرقائقي يحتاج إلى ان تعامل مع 30 دقيقه ضوء الاشعه فوق البنفسجية و 15 دقيقه تدفق الهواء قبل الاستخدام. تاكد من إغلاق الباب الزجاجي عندما يكون ضوء الاشعه فوق البنفسجية علي. رش جميع الاداات واللوحات مع 70 ٪ الايثانول قبل وضعها في مجلس الوزراء.</li>
	<li>اعداد Murashige و Skoog (MS) المتوسطة في القياسية 90 mm-قطرها طبق بيتري تحت مجلس الوزراء تدفق الرقائقي. ملاحظه: تحتوي MS متوسطه علي المكونات التالية: 20.6 mM NH4NO3, 18.8 mm KNO3, 1.25 mm KH2PO4, 1.5 mM Mgso4· 7h2, 3 مم cacl2· 2h2o, 0.1 mm mnso4· ح2س ، 1.03 μm Na2MoO4· 2H2س ، 0.1 MM ح3بو3، 30 ΜM Znso4· 7h2س ، 0.1 μM cuso4· 5H2س ، 0.1 μM cocl2· 6h2o ، 1.39 μm كي ، 97 μ م FeSO4 · 7H2س ، 114.5 μm ايثيل الصوديوم حمض (أدتا) ، 4.07 μm حمض نيكوتينيتش ، 2.44 Μm بيريدوكسين hcl ، 0.15 Μm الثيامين hcl ، 2.68 mm الجليسين ، 555 μm ميو-اينوزيتول ، 87.7 mm السكروز و 10 غرام/لتر أجار.</li>
	<li>ترطيب النصائح المعقمة أو المسواك عن طريق لمس غيض أو المسواك إلى متوسط MS ، ثم تراجع البذور المعقمة واحدا تلو الآخر علي الموقف الثابت لكل طبق بيتري المشار اليها من قبل بطاقة البذر.</li>
	<li>ختم طبق بيتري مع فيلم البارافين وشريط لاصق ووضعه عموديا علي موقف واضح في غرفه النمو (22 درجه مئوية ، 70 ٪ رطوبة) مع دوره اليوم من 16 ساعة من الضوء و 8 ساعة من الظلام (الاضاءه من 6 صباحا إلى 10 مساءا). مصنع Arabidopsis جاهزه للتحميل cfda في اليوم 9-13 بعد البذر. ملاحظه: يتم تنفيذ الاجراء التالي في فتره ما بعد الظهر من الساعة 2 ظهرا حتى الساعة 5 مساء.</li>
</ol>2. CFDA التحميل مع اجراء قطع الجذر
<ol><li>اعداد جديد CFDA حل العمل علي الفور قبل الاستخدام. تمييع محلول الأسهم cfda 1 مم المخزنة في-20 درجه مئوية الفريزر مع المياه نقاء معقمه لتركيز العمل من 5 μM.</li>
	<li>قطع غشاء البارافين الصغيرة المساميه فيلم (انظر جدول المواد) إلى قطع صغيره من 3 مم × 3 مم الحجم.</li>
	<li>كشف النباتات المتزايدة في الغرفة في 22 درجه مئوية ومسح الرطوبة الزائدة مع منشفه ورقيه. ضع قطع الفيلم الصغيرة تحت كل جذر. ملاحظه: من هذا إلى الخطوة 2.6 ، يجب ان تكتمل العملية بأكملها في غضون 15 دقيقه.</li>
	<li>رفع النباتات علي غطاء طبق بيتري. قطع الجذور في موقف حوالي 5-10 مم تحت تقاطع الجذر-سويق. وضع الجزء تبادل لإطلاق النار مره أخرى إلى الفيلم علي المتوسطة.</li>
	<li>تطبيق بعناية 0.25 μL من CFDA علي نهاية القطع من كل جذر تحت المجهر تشريح. تجنب الرش إلى أجزاء أخرى من النبات.</li>
	<li>تغطيه لوحه وترك النباتات تحت الضوء ل 2-3 h (22 درجه مئوية) في غرفه النمو.</li>
	<li>شطف النباتات الملونة ثلاث مرات بالتتابع في ثلاثه أكواب منفصلة مليئه بالماء المقطر ، ثم مراقبه النباتات تحت المجهر الفلورية ستيريو مع التكبير من 1.4 x إلى 3.3 x (انظر جدول المواد). للكشف عن الفلورية ، واستخدام عاليه الكفاءة مرشح مكعب (470/20 nm الاثاره ، 495 nm الانقسام والانبعاثات 525/50 nm) شنت لنقل اشاره مضان.</li>
</ol>3. CFDA التحميل مع سويق-معسر الاجراء
<ol><li>اعداد جديد CFDA حل العمل علي الفور قبل الاستخدام. تمييع محلول الأسهم cfda 1 مم المخزنة في-20 درجه مئوية الفريزر مع المياه نقاء معقمه (انظر جدول المواد) إلى تركيز العمل من 5 μM.</li>
	<li>قطع غشاء البارافين الصغيرة المساميه فيلم (انظر جدول المواد) إلى قطع صغيره من 3 مم × 3 مم الحجم.</li>
	<li>كشف النباتات المتزايدة في الغرفة في 22 درجه مئوية ومسح الرطوبة الزائدة مع منشفه ورقيه. ملاحظه: من هذا إلى الخطوة 3.7 ، يجب ان تكتمل العملية بأكملها في غضون 15 دقيقه.</li>
	<li>وضع قطعه صغيره من الفيلم تحت تقاطع سويق الجذر لكل مصنع.</li>
	<li>استخدام ملقط لقرصه بلطف سويق بالقرب من تقاطع الجذر سويق تحت المجهر تشريح.</li>
	<li>تطبيق بعناية 0.1 μL من CFDA علي موقع الجرح تحت المجهر تشريح. تجنب الرش إلى أجزاء أخرى من النبات.</li>
	<li>تغطيه لوحه ، وترك النباتات تحت ضوء (22 درجه مئوية) ل 2-3 h.</li>
	<li>شطف النباتات الملونة ثلاث مرات بالتتابع في ثلاثه أكواب منفصلة مليئه بالماء المقطر ، ثم مراقبه النباتات تحت المجهر الفلورية ستيريو مع التكبير من 1.4 x إلى 3.3 x (انظر جدول المواد). للكشف عن الفلورية ، وجبل عاليه الكفاءة مرشح مكعب (470/20 nm الاثاره ، 495 nm الانقسام والانبعاثات 525/50 nm) لنقل اشاره مضان.</li>
</ol>

<ol><li>Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%285%29Carboxyfluorescein+as+a+tracer+of+phloem+sap+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation.</a> American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).</li>
<li>Wright, K. M., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+probe+HPTS+as+a+phloem-mobile%2C+symplastic+tracer%3A+an+evaluation+using+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy.</a> Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+Lucifer+Yellow+CH+in+potato+tuber+storage+tissues%3A+A+comparison+of+symplastic+and+apoplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport.</a> Planta. 176 (4), 533-540 (1988).</li>
<li>Knoblauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Phloem-Mobile+Probes%3A+Properties+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications.</a> Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).</li>
<li>Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+phloem+unloading+in+the+root+tip+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).</li>
<li>Viola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberization+in+Potato+Involves+a+Switch+from+Apoplastic+to+Symplastic+Phloem+Unloading%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading.</a> The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+Comparison+of+a+Fluorescent+Solute+with+a+Fluorescent+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus.</a> The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).</li>
<li>Péron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+Phloem+Unloading+and+Expression+of+Sucrose+Transporters+in+Vegetative+Sinks+of+the+Parasitic+Plant+Phelipanche+ramosa+L+%28Pomel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel).</a> Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).</li>
<li>Spallek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+hormonal+control+of+host+root+morphology+by+parasitic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).</li>
<li>Complainville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodule+initiation+involves+the+creation+of+a+new+symplasmic+field+in+specific+root+cells+of+medicago+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species.</a> The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).</li>
<li>Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+fluorescent+dyes+Lucifer+Yellow+%28LYCH%29+and+carboxyfluorescein+%28CF%29+in+Medicago+truncatula+Gaertn.+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules.</a> Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).</li>
<li>Robards, A. W., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).</li>
<li>Roberts, A. G., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+and+the+control+of+symplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata and the control of symplastic transport.</a> Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).</li>
<li>Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-coupling+in+the+root+epidermis+of+Arabidopsis+is+progressively+reduced+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development.</a> Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).</li>
<li>Palevitz, B. A., Hepler, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+dye+coupling+of+stomatal+cells+of+Allium+and+Commelina+demonstrated+by+microinjection+of+Lucifer+yellow%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow.</a> Planta. 164 (4), 473-479 (1985).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Kempers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+isolation+of+the+sieve+element-companion+cell+complex+in+the+phloem+of+Ricinus+communis+and+Salix+alba+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems.</a> Planta. 183 (1), 69-76 (1991).</li>
<li>Erwee, M. G., Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplast+domains+in+extrastelar+tissues+of+Egeria+densa+Planch%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch.</a> Planta. 163 (1), 9-19 (1985).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+communication+between+primary+and+developing+lateral+roots+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).</li>
<li>Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Unidirectional+Flow+through+Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata.</a> Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).</li>
<li>Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+symplasmic+domains+in+the+embryo+and+seed+of+Sedum+acre+L.+%28Crassulaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae).</a> Planta. 245 (3), 491-505 (2017).</li>
<li>Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Arabidopsis+spreads+from+the+root+to+the+shoot%2C+through+a+gating+barrier%2C+by+template-dependent%2C+non-vascular%2C+cell+to+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement.</a> Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).</li>
<li>Radford, J. E., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue-preparation-induced+callose+synthesis+on+estimates+of+plasmodesma+size+exclusion+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits.</a> Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).</li>
<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

وقد أظهرت الدراسات الناشئة ان النباتات يمكن ان تستجيب بسرعة للمؤثرات الخارجية23، بما في ذلك التلاعب التي أدخلت علي الإجراءات التجريبية22. في تجربتنا الاوليه ، غالبا ما تؤدي مراقبتنا لهذه المعرفة إلى تلطيخ الفشل. مع هذه الدروس ، ونحن نقترح ان توضع في الاعتبار الاحتياطات التالية عند تنفيذ هذه التجربة: (1) يجب ان تبقي البذور بعد الحصاد في خزانه التخزين تعيين إلى درجه حرارة منخفضه ورطوبة منخفضه. (2) ينبغي الحفاظ علي التلاعب في النباتات ، ولا سيما التعرض للهواء في مجلس الوزراء ،...

العديد من القصبات الفلورية مع مجموعه من الخصائص الطيفية ، مثل 5 (6)-كاربوكسيفلوريسسين (CF)1، 8-هيدروكسي برينيه-1 ، 3 ، 6-ثلاثي الفوسفات حمض2، إبليس الأصفر CH (lych)3، esculin و cter4، وقد وضعت و تطبيقها في النباتات لمراقبه حركه symplastic والنشاط لحاء. عموما ، يتم تحميل صبغه symplastic إلى قطع في الانسجه المستهدفة والتشتت متسلسلة من مراسل في أجزاء أخرى من النبات سوف تظهر الاتصالات بين الخلايا. علي الرغم من ان اليه امتصاص الصبغة غير مفهومه تماما ، فقد تم الاعتراف علي نطاق واسع بالمبدا الكامن وراء حركه CF داخل الخلايا الحية. شكل استر من CF (CF diacetate ، CFDA) غير فلوري ، ولكن غشاء نفاذيه. يسمح هذا خاصيه انتشار سريعة غشاء من الصبغ داخل خلايا. مره واحده داخل الخلايا الحية ، استراسيس في الخلايا أزاله مجموعات خلات في 3 ' و 6 ' موقف CFDA ، والإفراج عن CF وغشاء-غير نفاذه (الشكل 1، بدلا من ذلك الرجوع رايت وآخرون2) ؛ CF يمكن بعد ذلك التحرك من خلال الهيوليه إلى أجزاء أخرى من النباتات.
وهناك اجراء راسخ مع cfda هو انه يمكن تحميله في أوراق المصدر وتستخدم لمراقبه تدفق لحاء و لحاء تفريغ في الانسجه بالوعة من العديد من الأنواع ، علي سبيل المثال ، كما CF التفريغ في Arabidopsis الجذر5، لحاء تفريغ خلال البطاطا الدرني6، لحاء تفريغ في بالوعة نيكوتيانا يترك7، وهلم جرا. من خلال نهج التحميل مماثله ، اعتمدت دراسات أخرى هذه الصبغة لإثبات الاتصال symplastic بين المضيف والطفيلي8،9، أو للكشف عن العلاقات التكافلية10،11.
طريقه أخرى للاستفادة من هذه الصبغة هي لتحميلها في خلايا معينه أو خليه واحده عن طريق الحقن المجهري لتحديد نمط التوزيع الخاص به. وقد سهلت هذه التقنيات المتطورة إلى حد كبير فهمنا أعمق من الاتصالات الخلوية بوساطة plasmodesmata, لا سيما في تطوير مفهوم المجال symplastic12,13. علي سبيل المثال, الحقن المجهري لل cfda في الخلايا كوتيليدون من Arabidopsis أسفرت عن نمط اقتران صبغ في البشرة السويقه ولكن غير اقتران في الخلايا الاساسيه أو في البشرة الجذر, التالي فان البشرة السويقه تشكل symplastic المجال14. المجالات المماثلة ، مثل الخلايا الحرس المعدة15، غربال عنصر-رفيق الخلايا16، وخلايا الشعر الجذر14 والجذر كاب17، وقدتم تحديد18 من قبل تقنيه الحقن المجهري. والأكثر دهشة ان بعض المجالات تسمح لجزيئات التتبع بالتحرك في اتجاه معين. اتخاذ المجال [تريشم] علي سبيل المثال ، الحقن المجهري لمسبار الفلورسنت في خليه دعم البشرة يؤدي إلى تدفق المقتفي في مجال [تريشم] ، ومع ذلك ، لا يحمل الحقن العكسي صحيح19. وقد وجد تقرير صدر مؤخرا أيضا حالات مماثله في المجالات symplastic من الجنين Sedum 20. التالي ، فان جميع الحالات المذكورة أعلاه تعني ان مبادله مواقع التحميل قد تؤدي إلى رؤى جديده في الاتصالات البلاستيكية. تجربتنا السابقة تهدف إلى تشريح الطريق من الجذر إلى تبادل لإطلاق النار المحمول إسكات التعرف علي المجال الجديد symplastic ، أو HEJ (تقاطع سويق-ابيتوسيل) ، والتي تم التحقق كذلك من خلال تحميل الجذر (غير المتعارف عليها بالوعة التحميل) CFDA تجربه21. هنا ، ونحن أيضا وضع الجذر إلى تبادل لإطلاق النار CF الحركة باستخدام طريقه بسيطه واستعاده مجال symplastic المحتملة عن طريق تحويل مواقع التحميل. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تكييف هذا الاجراء للتمييز بين الخلفيات الوراثية التي غيرت النقل البري البري إلى التصوير لمسافات طويلة.

<table><tbody><tr><td>KNO3&nbsp; &nbsp;</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4& middot ؛ 7H2O</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>كاشف كيميائي سينوفارم</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>كاشف كيميائي سينوفارم</td><td>حمض البوريك</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4& middot; 7H2O</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>Sinopharm الكاشف الكيميائي</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&middot; 7H2O</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>كاشف كيميائي هيدروكسيد الصوديوم</td><td>سينوفارم</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td></td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>السكروز</td><td>كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>ميو-إينوزيتول &nbsp ؛ &nbsp;</td><td>ماكلين</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>حمض النيكوتينيك &nbsp;</td><td>ماكلين</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>بيريدوكسين هيدروكلوريك ماكلين</td><td></td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>ثيامين هيدروكلوريك ماكلين</td><td></td><td>T818865</td><td></td></tr><tr><td>جلايسين</td><td>ماكلين</td><td>G800880</td><td></td></tr><tr><td>مسحوق أجار</td><td>نوفون</td><td>ZZ14022</td><td></td></tr><tr><td>مجهر فلوري</td><td>زايس</td><td>أكسيو زوم V16</td><td></td></tr><tr><td>مجهر تشريح</td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200 & ل ماصة</td><td>أدوات مختبر التنين</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2.5 & mu ؛ ل ماصة</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>ملقط ناعم &nbsp ؛</td><td>الملقط</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>شفرة من الفولاذ المقاوم للصدأ على الوجهين</td> شفرة <td></td><td>جيليت</td><td>بلاتينيوم بلس ذات الحواف المزدوجة</td></tr></tbody></table>

حركه إطلاق النار من الراسم cfda المحملة في الانسجه بالوعة القاع من arabidopsis

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

وقد تم تطبيق الراسم symplastic 5 (6)-كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات (cfda) علي نطاق واسع في النباتات الحية لإثبات الاتصال بين الخلوية ، لحاء النقل والاوعيه الدموية زخرفه. يظهر هذا البروتوكول حركه كاربوكسيفلوريسسين (CF) من أسفل إلى اعلي في Arabidopsis باستخدام قطع الجذر والاجراء سويق-معسر علي التوالي. ينتج هذا اثنان إجراءات مختلفه في فعاليه مختلفه من [سف] حركه: حوالي 91% مظهر من [سف] في اليقذف مع ال [سويق-معسر] اجراء, حيث ان فقط حوالي 70% مظهر من [سف] مع ال [رو-بتر] اجراء. تغيير بسيط من مواقع التحميل ، مما ادي إلى تغييرات كبيره في كفاءه المحمول من هذه الصبغة symplastic ، يوحي حركه CF قد تكون خاضعه للتنظيم symplastic ، علي الأرجح من قبل تقاطع سويق الجذر.

وغالبا ما تخضع حركه symplastic للتقلبات البيئية. اضطراب الحالة التي تنمو في النبات ، وحتى عمليه اعداد الانسجه سوف تؤثر علي الحد من حجم الاستبعاد من plasmodesmata ، التالي تؤثر علي النقل symplastic22. لتحسين كفاءه تلطيخ ، ونحن حصر عملياتنا في غرفه النمو ، حيث يتم التحكم في درجه الحرارة والرطوبة باحكام ، وأيضا تنفيذ الاجراء بأكمله في أسرع وقت ممكن (من الناحية المثالية في غضون 10-15 دقيقه بعد رفع غطاء طبق بيتري). هذه الاحتياطات خلال تجربه يمكن ان تقلل بشكل فعال من معد...

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفيه تحميل CFDA إلى مواقع مختلفه من الأجزاء السفلية من Arabidopsis. ثم نقدم نمط التوزيع الناتج من CF في البراعم.

حركه إطلاق النار من الراسم CFDA المحملة في الانسجه بالوعة القاع من Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

المسبار المستخدمة على نطاق واسع CFDA، أو قصيرة لsdiacetate carboxyfluorescein، غير فلورية. المجموعتين H3 وموقف 3'6'على هذا المركب جعله غشاء permeant. حيث مرة واحدة داخل الخلايا، خلات الخلوية الداخلية سوف إزالة مجموعات خلات والإفراج عن شكل جديد من CFDA.هذا هو carboxyfluorescein ، أو CF ، وهو الفلورسنت. ولأن هذا الشكل الجديد هو أقل غشاء permeant، والوزن، وجميع الخلايا هو التحرك من خلال المسام بين الخلايا، أو plasmodesmata في النباتات، وهذا يجعل هذا diacetate التحقيق المثالي لدراسة النقل بين الخلايا في نشاط الفليم. في فيديو اليوم، سنقوم بإثبات تحميل CFD في جذر و نقصcotyl من النباتات Arabidopsis على التوالي، وسوف نظهر كيف اثنين من الإجراءات المختلفة قليلا سوف تؤثر على أسفل إلى أعلى حركة هذا المسبار الفلورسنت.تحقيق نتائج تلطيخ باستمرار، ونحن تخزين بذور Arabidopsis حصادها في أربع درجة مئوية، 40٪ مجلس الوزراء الرطوبة. وتستخدم البذور التي تم حصادها حديثا في هذه الحالة لأكثر من سبعة أيام بسهولة لبذر. لضمان زراعة كل مصنع في مساحة مماثلة نسبيا في طبق بيتري، ونحن نستخدم بطاقة درجة منطقة البذور.الآن، ترطيب طرف تعقيم، تراجع في البذور تعقيم، وزرع البذور واحدا تلو الآخر على الموقف المعين. بعد الانتهاء من البذر، ختم طبق بيتري مع البارا فيلم وشريط لزجة، ووضعها على موقف طبق بيتري للسماح لها تنمو عموديا. هنا هي الأدوات التي نحن ذاهبون لاستخدامها في هذه التجربة.يرجى ملاحظة أننا أفضل تحميل الصبغة بأسرع ما يمكن. عادة، يمكنك الانتهاء من العملية برمتها في 10 إلى 15 دقيقة. قبل أن نقوم بتجربة تحميل CFDA، نقوم دائمًا بإعداد حل CFDA جديد.هنا، تمييع CFDA المليمولار واحد إلى خمسة تركيزات ميكرومولار مع الماء قبل الاستخدام الفوري. قطع parafilm إلى قطع صغيرة في ثلاثة في ثلاثة ملليمتر الحجم. لأن هناك تكثيف على غطاء وأسفل طبق بيتري، ونحن بحاجة إلى مسح بها مع منشفة ورقية لتجنب صبغ تتدفق حولها.يتم وضع قطعة صغيرة من البارا فيلم تحت الجذر. رفع النباتات ووضعها على الغطاء. قطع الجذور حوالي خمسة إلى 10 ملليمتر تحت المهيبوكول.خذ يطلق النار مرة أخرى على قطعة صغيرة من البارا فيلم. الآن تطبيق بعناية CFDA ميكرولتر واحد على نهاية القطع من الجذر. في محاولة لتجنب تلويث جميع النباتات بروتو.ثم تغطية الغطاء، ثم تركها في غرفة النمو لمدة ساعتين. طريقة هيبوكو تيل معسرة. يتم وضع قطعة البارا فيلم الصغيرة ، كما تم إعدادها مسبقًا ، تحت تقاطع الـ root-hypocotyl.نستخدم a forecep إلى بلطف قرصة hypocotyl قريبة من أنسجة الجذر، وتطبيق بعناية 0.1 microliter CFDA على الجانب مقروص وترك النبات لمدة ساعتين. الصور من تسعة إلى 12 يوما بعد منطقة تلطيخ النباتات. أنها تظهر جميع نمط تلطيخ الأوعية الدموية في كل من كوتيليفدون والأوراق الحقيقية.فقط في حالة نادرة جدا، وأظهرت ورقة كوتيليدون نمط تلطيخ نصف ورقة. حتى في الأساس ، لم اثنين من الطرق لا تحدث فرقا في نمط تلطيخ CF ، ولكن إذا كنا تنفيذ صبغ التحميل في المزيد والمزيد من النباتات ، نجد اثنين من الإجراءات تعطي صفقة فرق كبير في الكفاءة. مع طريقة قطع الجذر، حوالي 70٪ من النباتات تظهر إشارة الفلورسنت في تبادل لاطلاق النار.ولكن يمكن زيادة الكفاءة إلى 91٪ باستخدام طريقة نقصcotyl معسر. حاولنا أيضا طريقة معسر الجذر، ولكن هذه الطريقة تؤدي إلى انخفاض الكفاءة، انها حوالي 30٪ ولذلك، يبدو أن طريقة لتحميل صبغة لا يفسر الفرق تلطيخ. والفرق يكمن على الأرجح في مواقع التحميل، التي قد تكون مفصولة بحاجز تكافلي.أظهرنا كيف نقوم بتحميل CFDA في جذور Arabidopsis و hypocotyl. استخدمنا اثنين من الإجراءات المختلفة قليلاً، وهاذين الإجراءين مختلفة قليلاً يؤدي إلى اختلاف كبير في هذا الجزء السفلي إلى أعلى حركة التحقيق. نقترح أن هذه الطريقة يمكن أن تساعدنا على تحديد حاجز symplastic المحتملة لإشارات تبادل لاطلاق النار المستمدة من الجذر.

shootward-movement-cfda-tracer-loaded-bottom-sink-tissues

Research

JoVE Journal

Environment

البيئة

ويجري التحقيق في الأساس الجزيئي للمكانية محددة ردود فيتوكروم استخدام النباتات المعدلة وراثيا التي تظهر الأنسجة والأعضاء القصور فيتوكروم محددة. عزل خلايا معينة العارضة التي يسببها استنزاف حامل اللون فيتوكروم التي الإسفار المنشط الخلية فرز تليها تحليلات ميكروأري يجري استخدامها لتحديد الجينات المسؤولة عن ردود فيتوكروم مكانية محددة.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

ويمكن تقييم الاتجار الجزيئات بين الخلايا النباتية بالإعراب عابر بروتين fluorescently الموسومة المصالح وتحليل توزيعه داخل وبين الخلايا بواسطة المجهر مبائر.

خلية الى خلية ضخم الجزيئات النقل الفحص في بلانتا الاستفادة من قصف Biolistic

نحن تصف استخدام perfluorodecalin كوسيط الارتشاحي المتزايدة. هذه هي طريقة بسيطة لتحسين عمق في...

طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

تنص هذه المادة على بروتوكول للزراعة شتلات Arabidopsis في RootChip، منصة التصوير ميكروفلويديك الذي يجمع بين التحكم الآلي من شروط النمو مع مراقبة جذر المجهرية والحنق القائم على قياس مستويات الأيض داخل الخلايا.

الوقت الفاصل بين التصوير الإسفار من نمو الجذور Arabidopsis مع التلاعب السريع للبيئة الجذر باستخدام RootChip

كاليفورنيا 2+ إشارات تنظم العمليات البيولوجية المختلفة في النباتات. هنا نقدم النهج لرصد يسببها الإجهاد اللاحيوي الكالسيوم المكاني والزماني 2+ الإشارات في الخلايا والأنسجة باستخدام المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ مؤشرات Aequorin أو Case12 نبات الأرابيدوبسيس.

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا 2+ إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

نحن تقرير طريقة بسيطة ومرنة لإجراء تصوير لايف الفلورسنت من أوراق نبات التمويل على مدى فترة ممتدة من الوقت. ونحن نستخدم نبات نبات المعدلة وراثيا معربا عن جين مراسل فلورسنت تحت سيطرة المروجين المتعلقة بالحصانة كمثال لفهم الاستجابات المناعية مصنع الزمانية المكانية.

أسلوب متعدد الاستخدامات لتركيب نبات يترك لتصوير الوقت الفاصل بين إينترافيتال

ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) يوفر إمكانية تشريح البرامج التنموية مع الحد الأدنى من معالجة الأعضاء والأنسجة. ينتج البروتوكول عن الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا المستهدفة ببروتين فلورسنت أخضر (GFP) يسمى وحدة فرعية من الريبوزيوم. تكشف أدوات التحليل المصب، مثل qRT-PCR أو RNA-seq، عن ملفات تعريف التعبير الخاصة بنوع الأنسجة والخلايا.

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

إن إشارات الكالسيوم الجهازية التي تسببها الغلوتامات خارج الخلية أمر بالغ الأهمية لتحريض استجابات الدفاع النباتي على الجرح الميكانيكي وهجوم الحيوانات العاشبة في النباتات. توضح هذه المقالة طريقة لتصور الديناميكيات المكانية والزمنية لكل من هذين العاملين باستخدام نباتات Arabidopsis thaliana التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية الحساسة للكالسيوم والغلوتامات.

تصوير واسع المجال وفي الوقت الحقيقي للإشارات الجرح المحلية والجهازية في Arabidopsis

يتم تقديم العديد من الطرق الشائعة الاستخدام هنا لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء لمستقبلات غشاء البلازما كيناز. تصف هذه المخطوطة البروتوكولات التفصيلية بما في ذلك تحضير المواد النباتية والمعالجة الدوائية وإعداد التصوير متحد البؤر.

الطرق القائمة على الصور لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء في خلايا سلالة الثغور

اكتشف تحميل CFDA في جذور وسويقات Arabidopsis لدراسة النقل الخلوي بين الخلايا النباتية. يُظهر هذا البروتوكول كفاءة طرق التحميل المختلفة في تصور حركة المسبار الضوئي.

حركه إطلاق النار من الراسم CFDA المحملة في الانسجه بالوعة القاع من Arabidopsis

استكشف المزيد من الفيديوهات