فحص الهجرة الصفر وغرفة الجلد السمرة لتحليل في المختبر وفي الجسم الحي للشفاء الجروح
September 26th, 2019
هنا، نقدم بروتوكول احتساء الصفر في المختبر باستخدام الخلايا الليفية الأولية ولإجراء اختبار التئام الجروح في الجلد في الجسم الحي في الفئران. كلا الاختبارين هما طريقتان مباشرتان لتقييم الجروح في المختبر وفي الجسم الحي.
يحتاج المتمردون إلى علاج الجروح الجلدية. لتحديد الجزيئات المستهدفة لعلاج الأدوية، يلزم إجراء اختبارات في المختبر وفي الجسم الحي. النظم المناسبة هي في المختبر خدش المقايسة، وفي الجسم الحي الظهري الجلد أضعاف الغرفة.
كلاهما إجراءات مباشرة إلى الأمام لرصد الهجرة الخلية والجلد التئام الجروح, في غياب ووجود المركبات النشطة دوائيا. على الرغم من أن كلا التقنيات هي مباشرة إلى الأمام، ينبغي للمحققين ممارسة تطبيق الصفر. والجلد الظهري أضعاف زرع غرفة، والجرح للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار.
سيتم عرض الإجراءات من قبل الدكتور ماتياس لاشكي، وهو جراح وأستاذ من معهد الجراحة السريرية والتجريبية. قبل البدء في الإجراء، استخدم علامة دائمة فائقة الدقة لوضع علامة على لوحة واحدة من ستة أطباق جيدة لكل نوع خلية، مع خط أفقي في أسفل كل بئر لتحديد منطقة الصفر لكل ثقافة. المقبل لوحة الألياف الأولية الانفجارات معزولة عن نوع البرية وبيتا 3 الفئران ناقص، في لوحة ستة بئر في 5 مرات 10 إلى انفجارات الألياف الخامسة لكل تركيز جيد.
في 2mL من DMEM تكملها مع 10٪ مصل الأبقار الجنين. تسمية لوحات مع نوع الخلية، واكتب وراثي وتاريخ. ووضع لوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة.
في صباح اليوم التالي إضافة 9 ميكرو لتر من كل مبيد الدهون على أساس transfection الفائدة، إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة الفردية التي تحتوي على 150 ميكرو لتر من متوسطة المصل مخفضة لكل أنبوب. إضافة 1.5 لتر صغير من سيرنا إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ثاني لكل كاشف طارد يحتوي على 150 لتراً ميكروً من متوسط المصل المخفض لكل أنبوب. وخلط كل حل سيرنا مع أنبوب واحد من محلول كاشف transfection.
بعد دوامة لفترة وجيزة مكان المخاليط في 21 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أثناء الحضانة استبدال بعناية supernate في كل بئر. مع 2.25mL من الثقافة الطازجة المتوسطة أسفل الجانب من الآبار.
في نهاية الحضانة إضافة 250 لتراً من المزيج كاشف الترانف siRNA المناسبة، إسقاط الحكمة في كل بئر المقابلة من الخلايا. وإرجاع اللوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 72 ساعة. عندما وصلت الخلايا إلى 100٪التقاء، تجاهل ثقافة مفوج من كل بئر.
واستخدام 200 ميكرو لتر ماصة تلميح لخلق الصفر في أحادية الخلية التقاء. عمودي إلى خط أفقي ملحوظ في الجزء السفلي من كل بئر. ثم شطف بعناية كل الجرحى جيدا 2 مرات مع 2mL من PPS لكل غسل.
لإزالة أي عوامل مفرج عنها من الخلايا التالفة، وخلايا فضفاضة أو الحطام من المنطقة خدش. بعد غسل الثانية إضافة 2mL من ثقافة الخلية الطازجة المتوسطة تكملها المصل 1 أو 10 في المئة إلى كل بئر. والتقاط صور الجروح في كل لوحة على خشبة المسرح من المجهر الخفيف.
مباشرة بعد الخدش في التكبير 10X. ثم العودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية. الاستمرار في التقاط الصور في نقاط الوقت التجريبية المناسبة لل30 ساعة القادمة.
في نهاية التجربة كميّة الأولى خلية منطقة حرّة و متبقّي منطقة بعد 6, 10 و30 ساعات من ثقافة. لتحديد النسبة المئوية لمنطقة التسويد التي تمت إعادة اكتظاظها بواسطة الخلايا المُهاجرة نسبة إلى منطقة التسويد الأولية. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القارص، في النوع البرية أو بيتا ثلاثة خروج المغلوب C57 الأسود ستة الماوس، حلق بعناية dorsum.
و تطبيق مرهم على عيون الحيوان تطبيق كريم إزالة الشعر للقضاء على أي الشعر المتبقية. إزالة كريم بعد 10 دقائق.
لتحضير غرفة التيتانيوم، قم بإصلاح جزء واحد من إطار غرفة التيتانيوم المتناظرة، مع مسامير متصلة بالمكسرات. للحفاظ على 400 إلى 500 ميكرومتر بين جزأين متماثلين من الغرفة. لتجنب ضغط من فَيَصل الدم في الجلد.
تطهير الجلد المكشوف مع 70٪ الإيثانول. وفهم أضعاف من الجلد أمام مصدر الضوء. ضع الخط الأوسط للطبقة المزدوجة من الجلد إلى حيث سيتم زرع غرفة التيتانيوم.
و cranially وcaudally إصلاح أضعاف الجلد مع خياطة البولي بروبلين. شدّ على الجانب الآخر من الغرزة على رف معدني لرفع الجلد المطوي. وضبط ارتفاع الرف للسماح للماوس للجلوس بشكل مريح.
خياطة الإطار الأول من غرفة التيتانيوم من قبل خياطة البولي بروبلين على حافة متفوقة على الجزء الخلفي من أضعاف الجلد الظهرية. بعد إعادة تأكيد التخدرية استخدام مقص غرامة لجعل شقوق صغيرة في الجلد. وتمرير اثنين من مسامير ربط تعلق على النصف الأول من غرفة التيتانيوم من خلال قاعدة أضعاف الجلد.
إزالة الماوس من الرف، ووضع الحيوان في موقف الجانبي. ضع النصف الثاني من غرفة التيتانيوم على قمة 3 مسامير متصلة. و تطبيق ضغط طفيف يدويا لتمرير هذه المسامير من خلال النصف الثاني من الإطار التيتانيوم.
تقع طبقة الجلد المطوية الآن بين نصفي نصفي إطار التيتانيوم. ثم إصلاح كل من أجزاء متناظرة مع المكسرات الفولاذ المقاوم للصدأ. باستخدام 2mL قياس 2 مل خزعة قطرها، علامة على منطقة الجرح في وسط الجلد، داخل نافذة المراقبة من غرفة الجلد أضعاف.
واستخدام ملقط غرامة ومقص لإزالة البشرة بأكملها والأدمة داخل العلامة. لخلق جرح دائري. تنظيف 3 ونصف إلى 4 ونصف ميلمتر مربع الجرح مع 0.5mL من المالحة العقيمة.
وغطّي الجرح بغطاء زجاجي استخدام كماشة خاتم المفاجئة على غرفة التيتانيوم لإصلاح غطاء في مكان. ونقل الماوس على الفور إلى مرحلة التصوير من منظار مجسم.
ثم صورة الجرح في التكبير 40X. قبل وضع الماوس في قفص مع مراقبة حتى الشفاء الكامل. بعد إنشاء خدش باستخدام 200 ميكرو لتر ماصة تلميح كما هو موضح, في هذه التجربة التمثيلية, هاجرت الخلايا من كلا النمطين الجيني في منطقة الصفر وأغلقت الفجوة.
ثم تم تحديد كمي ترحيل الخلية كنسبة مئوية من منطقة نقطة الصفر التي أعيد إسكانها بواسطة الخلايا المهاجرة 6 ساعات بعد إجراء نقطة الصفر. على سبيل المثال في هذه التجربة ترحيل Cav beta 3 النفثالين الألياف الانفجارات أغلقت منطقة الخدش بشكل ملحوظ في وقت سابق من الألياف الانفجارات من الفئران نوع البرية. لتأكيد تأثير Cav beta 3 المعتمدة التي لوحظت في كاف بيتا 3 نقص الألياف الانفجارات, تم نقل أنواع البرية الألياف الانفجارات مع سيرنا إلى أسفل تنظيم كاف بيتا 3 البروتين.
الألياف الانفجارات تعامل مع كاف بيتا 3 siRNAs محددة تصرفت مثل بيتا 3 الانفجارات الألياف ناقص. لمقارنة التئام الجروح بين كلا النمطين الجينيين، تم تصوير منطقة الجرح في غرفة طي الجلد مباشرة بعد الإصابة. و تم تصوير الجرح خلال الأسبوعين القادمين
تم قياس أحجام الجروح على الصور ومنطقة الجرح ، في يوم معين تم التعبير عنه كنسبة مئوية من منطقة الجرح الأولي. كما هو متوقع تم زيادة معدل إغلاق الجرح في كاف بيتا 3 الفئران ناقصة بالمقارنة مع الضوابط نوع البرية. تأكد من تطبيق ضغط متساو على طرف الماصات، لكل خدش وتطابق الخدوش إلى خطوط ملحوظ على لوحة أسفل أقرب ما يمكن.
يمكن فتح نافذة المراقبة لغرفة الجلد الظهرية أضعاف في أي وقت خلال عملية الشفاء. السماح للتطبيق الموضعي للمركبات النشطة الدوائية المختلفة. ومن الممكن أيضاً أن تُخَفَّر المنطقة المصابة في مراحل مختلفة من عملية الشفاء.
للبروتين الجزيئي البيوكيميائي أو التحليل النسيجي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولات لإجراء اختبارات الخدش في المختبر باستخدام الخلايا الليفية الأولية وخبرات التئام الجروح الجلدية في الجسم الحي في الفئران. تم تصميم هذه الطرق لتقييم التئام الجروح بشكل فعال في كل من النماذج المختبرية والحيوانية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التئام الجروح
- هجرة الخلايا
- اختبارات في المختبر وفي الجسم الحي
الخلفية
- تتطلب جروح الجلد استراتيجيات علاج فعالة.
- من الضروري تحديد الجزيئات المستهدفة لعلاجات العقاقير.
- تعد أنظمة الاختبار في المختبر وفي الجسم الحي ضرورية للبحث.
- تشمل الطرق الشائعة اختبارات الخدش وغرف طيات الجلد الظهري.
غرض الدراسة
- لتوفير بروتوكولات مباشرة لتقييم التئام الجروح.
- تسهيل مراقبة هجرة الخلايا.
- لتمكين الباحثين من تقييم التأثيرات الدوائية على التئام الجروح.
الطرق المستخدمة
- اختبار الخدش في المختبر مع الخلايا الليفية الأولية.
- اختبار التئام الجروح الجلدية في الجسم الحي في الفئران.
- مراقبة هجرة الخلايا في كلا الاختبارين.
- تقييم المركبات النشطة دوائيًا.
النتائج الرئيسية
- كلا الاختبارين فعالان لدراسة التئام الجروح.
- يمكن الحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار مع الممارسة.
- تسمح كلتا التقنيتين بتقييم علاجات العقاقير.
- توفر رؤى حول آليات التئام الجروح الجلدية.
الاستنتاجات
- البروتوكولات بسيطة وسهلة الوصول للباحثين.
- يمكن استخدامها لتعزيز فهم التئام الجروح.
- تدعم هذه الطرق تطوير استراتيجيات علاجية جديدة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Establishing predictive models for wound healing is critical in dermatology and regenerative medicine R&D, where identifying compounds that modulate cell migration and tissue repair can accelerate therapeutic development. The scratch migration assay and dorsal skinfold chamber model provide complementary in vitro and in vivo systems to evaluate pharmacological effects on wound closure kinetics. These assays support target validation and mechanistic de-risking by enabling quantitative assessment of wound healing phenotypes across experimental systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cell migration and wound repair pathways.
- Operational Value: Supports functional target validation by comparing wild-type and genetically modified or siRNA-treated fibroblasts.
- Predictive Value: Correlates in vitro migration rates with in vivo wound closure to prioritize hits for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducible readouts of gap closure and wound area reduction over time.
- Operational Value: Standardizes wound creation and imaging protocols to ensure consistency across plates and animals.
- Scalability: The scratch assay format is amenable to multi-well plate use for compound screening prior to in vivo confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant readouts in genetically defined models (e.g., Cavβ3 deficiency) to assess pathway-specific contributions to healing.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of wound closure in vivo with intravital imaging via the dorsal skinfold chamber.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings with in vivo phenotypic validation to support go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The assay pair functions as a discovery-to-validation cascade: in vitro screening identifies modulators of fibroblast migration, which are then tested in the dorsal skinfold chamber to confirm effects on tissue-level wound repair in a living system.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on genes or compounds influencing cell motility and extracellular matrix dynamics.
- Screening: The scratch assay enables high-throughput assessment of migration rates in primary fibroblasts under various treatment conditions.
- Analytics: Delivers quantitative metrics such as percentage of scratch repopulation and wound area reduction, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Supports continuity from cellular migration assays to intact tissue healing models, reinforcing mechanistic confidence.
- Enterprise Reuse: Both assays are adaptable to different cell types, genotypes, and pharmacological perturbations, supporting reuse across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target phenotypes by correlating cellular and tissue-level wound healing responses.
- Operational Value: Promotes assay standardization through defined scratch dimensions, imaging timepoints, and wound measurement protocols.
- Strategic Value: Improves resource allocation by enabling early triage of compounds using scalable in vitro models before in vivo investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decision-making by providing orthogonal validation of wound healing activity across model systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, transfection, and microscopic imaging techniques.
- Depends on access to cell culture incubators, inverted microscopes, and stereomicroscopes for longitudinal imaging.
- Necessitates standardized training for consistent scratch application and chamber implantation to minimize variability.
- Must account for species- and genotype-specific differences in baseline wound healing rates when interpreting results.
- Limited to acute wound models; may not fully recapitulate chronic healing impairments seen in diabetic or aged tissues without additional modifications.
