إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

هذا البروتوكول تحليل الخلايا الشامل يحافظ على سلامة نخاع العظام كله، مما يسمح إنقاذ المعلومات التي فقدت أثناء إعداد العينة التقليدية لتحليل الخلايا تحت درس. هذا البروتوكول السريع وغير جهد عزل نخاع العظام يسهل الحصول على مجموعات الخلايا النخاعية غير قابلة للحياة قابلة للحياة مثل المجموعات الفرعية نادرة العدلات النسب. استخدام قياس الخلايا الشامل لتحديد سابقا تحت تقدير الخلايا المناعية مثل خلايا النسب العدلات قد يكون لها آثار واسعة لمجموعة واسعة من الأمراض.

يحافظ هذا البروتوكول على سلامة الخلايا النخاعية القصيرة التي تعيش في نخاع العظم ويمكن تطبيقها بسهولة على أنواع الأنسجة الأخرى مثل الورم الصلب. نحن تبسيط بروتوكول لجعله سهل الاستعمال قدر الإمكان، ولكن كما هو الحال في جميع الدراسات البيولوجية قد تحتاج إلى عدد قليل من الممارسة يدير لإدارة. عندما تفعل هذا في المرة الأولى، يمكنك الحصول على جميع الكواشف الخاصة بك جاهزة أولاً ومن ثم تتبع بدقة البروتوكول.

إذا واجهت أي مشاكل، يمكنك الاتصال بـ CyTOForum والتحدث مع مستخدمي CyTOF الآخرين الذين يمكنهم المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. لإعداد العينة البيولوجية، يمكن أن تحدث الحيل البسيطة فرقا كبيرا مع النتيجة النهائية. العرض التوضيحي المرئي أسهل بكثير بالنسبة للمستخدم الجديد لفهم البروتوكول.

إذا كنت تفعل هذا للمرة الأولى، يمكنك الحصول على الكواشف الخاصة بك جاهزة أولاً ثم اتبع بدقة البروتوكول. لحصاد نخاع العظم، ضع ستة إلى 10 أسابيع من العمر C57 أسود ستة ماوس في موقف supine على وسادة جراحية معقمة واستخدام 70٪ الإيثانول لتعقيم البطن والأطراف الخلفية. استخدمي مقص جراحيّ لتشريحه لفتح تجويف البطن وإزالة الجلد لفضح الأطراف الخلفية.

باستخدام زوج من ملقط خلع الملابس تيب حادة، عقد الساق الماوس الحق تحت الكاحل واستخدام زوج من ملقط خلع الملابس المنحنية لتحقيق الاستقرار في الساق تحت ملقط خلع الملابس ة هاب حادة. استخدام ملقط خلع الملابس مقلوب حادة لكسر الساق وإزالة العضلات لفضح العظام. قبل وضع الساق في PBS الباردة، نقل ملقط خلع الملابس المنحنية الاستقرار إلى عظم الفخذ وشريحة ملقط خلع الملابس حادة يميل تحت مفصل الركبة لعقد الركبة.

سحب بلطف ما يصل إلى خلع الركبة وإزالة العضلات من الركبة لفضح عظم الفخذ. عقد عظم الفخذ المكشوفة من قبل ملقط خلع الملابس المنحنية واستخدام مقص الجراحية لقطع عظم الفخذ من الجزء السفلي من العظام. ثم ضع عظم الفخذ في برنامج تلفزيوني.

بعد ذلك، استخدم إبرة قياس 18 لكمة ثقب في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 0.5 ملليلتر ووضع كل من العظام في الأنبوب مع الأطراف المفتوحة للعظام التي تواجه الهبوط في الحفرة. ضع أنبوب 0.5 ملليلتر في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.7 ملليلتر وتدور الأنابيب ذات الطبقات المزدوجة في جهاز طرد مركزي صغير. في نهاية الطرد المركزي، تأكد من أن نخاع العظم قد تم استخراجه إلى أسفل الأنبوب.

لطخة خلايا نخاع العظام لعملية استئصال الخلايا الشامل, إعادة تعليق نخاع العظم في ملليلتر واحد من خلايا الدم الحمراء العازلة تحلل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. تصفية الخلايا من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وغسل الخلايا مع تسعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد، الباردة.

إعادة تعليق بيليه خلية نخاع العظام في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد, الباردة لحساب ونقل خمس مرات 10 إلى aliquot الخلية السادسة في أنبوب جديد 15 ملليلتر. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من كتلة الخلايا التلطخ العازلة، تستكمل مع 125 سيسبلاتين نانومولار. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا في أربعة ملليلتر من عازلة استئصال الخلايا الكتلة الطازجة.

إعادة تعليق بيليه في 50 microliters من FC مستقبلات حظر الحل. بعد 10 دقائق في أربع درجات مئوية، إضافة 50 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة من الفائدة إلى الخلايا ولأنابيب بلطف لخلط. درجة الحرارة في مختلف خطوات الحضانة هي مهمة جدا في الحفاظ على صلاحية خلايا نخاع العظام.

بعد 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، وغسل الخلايا مرتين في مليلترين من كتلة جديدة عازلة قياس الخلايا في غسل قبل إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من إعداد حديثا 1.6٪ الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من عازلة بيرم ثابت تكملها 125 حل التشابك نانوموللار لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. قبل تحليل الخلايا عن طريق قياس الخلايا الشامل، دوامة بلطف والطرد المركزي تعليق الخلية قبل غسل الخلايا في مليلتر اثنين من خلايا الخلايا الطازجة التلطخ العازلة.

بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين في ملليلتر واحد من الماء المقطر لكل غسل، وpirating بعناية عظمى بعد الغسيل الثاني قبل إعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من تركيز العازلة قياس الخلايا الشامل لتحليل القياسات الخلايا الشامل. في هذا T موزعة مؤامرة تضمين الجار العشوائي، والخلايا عبر أنسجة الماوس متعددة كانت مجمعة في مجموعات فرعية استنادا إلى التشابه من ملامحها تعبير علامة سطح كما تقاس من قبل 33 معلمة لوحة القياسات الحرارية الشامل. الخلايا ذات الخصائص الأكثر تشابهًا تم تجميعها تلقائيًا معًا استنادًا إلى التعبير عن هذه العلامات على كل خلية.

باستخدام هذه الطريقة، تم الحفاظ على سلامة نخاع العظام كله، مما أدى إلى اكتشاف سكان الخلايا غير معروف سابقا أن في وقت واحد يشارك في تعبير العدلات وtemmatopoietic الجذعية والخلايا السلف علامات سطح التوقيع. هذا العدد من الخلايا، التي تم حذفها سابقا في الدراسات السلف النخاعي، بسبب استنفاد الخلايا الإيجابية Ly6G، معارض نمط متميز من التعبير علامة السطح. والأهم من ذلك، أدت هذه البيانات إلى اكتشاف مجموعة فرعية صغيرة من مجموعة الخلايا الإيجابية Ly6G التي لا تعبر عن Ly6G، ولكن تم تجميعها بشكل وثيق مع الخلايا الإيجابية Ly6G Ly6G الإيجابية CD117، مما يشير إلى تشابه هذه الخلايا مع نسب العدلات استنادًا إلى التعبير عن علامات السطح 33 المستخدمة في هذه التجربة العملية cycytometry.

ويمكن بناء لوحة فرز الخلايا المنشطة 13 لونًا، مما يسمح بعزل أسبقية العدلات عن طريق قياس التدفق الخلوي للمقايس الوظيفية المصب. من المهم إجراء عملية عزل نخاع العظم في أسرع وقت ممكن والحفاظ على الخلايا عند أربع درجات مئوية أثناء إجراء التلطخ.