خزعة الكيسة الكيسية البشرية والتزجيج

وقد كانت كل من خزعة الكيس الفوتيست والتجويل ثورة في التلقيح الاصطناعي، والتخصيب في المختبر، مما يسمح لأطباء الأجنة من جميع أنحاء العالم لإجراء الاختبارات الجينية قبل الزرع على الأجنة البشرية مع الحد الأدنى من المخاطر على الجنين. سمحت خزعة تروفكتوديرم باستعادة حوالي سبع خلايا من جنين كامل النمو، مما مكن من إجراء تحليل وراثي قوي للمصب. وعلاوة على ذلك، لم يظهر أي أثر لهذا النهج حتى الآن.

الكفاءة السريرية لهذا العمل يسمح للمرضى الذين يعانون من ظروف أحادية وجميع هؤلاء المرضى الذين يعانون من زيادة خطر الشذوذ الكروموسومات داخل الكيسة البلاستك للاستفادة من التجارب الجينية قبل الزرع. ولا يزال هناك مجال لتحسين الاستراتيجيات الحالية لاختيار الأجنة. على سبيل المثال، يمثل التنميط البروتومي والبروتيومي خيارات مثيرة للاهتمام لاستكمال الاختبارات الجينية قبل الزرع على خزعة واحدة من الترومنكتد.

المشغلين غير تجربة غالبا ما النضال مع فتح واختراق pellucida زونا. إنها مسألة تركيز فقط وينبغي أن يكون الكيسة blastocyst ، والهدف ليزر ، والماصات على نفس المستوى البؤري.

بعد وضع علامة على طبق الخزعة مع تفاصيل المريض ، مع علامة دائمة غير سامة ، عدد كل قطرة 10 ميكرولتر من المتوسط العازلة من HEPES مع الجنين ودورة ID.Using 300 ميكرومتر تجريد ماصة ، ونقل قابلة للحياة ، وتوسيع كامل الكيسة الأرمصة إلى أول قطرة من طبق الخزعة وشطف قطرة لإزالة المتوسط الثقافة الزائدة ، قبل تحريك الكيسة البلاستكية في قطرة ثانية في الطبق. ضع الطبق تحت مجهر مقلوب، وافتحي ماصة الخزعة مع متوسطة من القطرة الثالثة من طبق الخزعة. تحت التكبير 20 مرة، وتوجيه الكيسة للحصول على رؤية واضحة للكتلة الخلية الداخلية في الساعة السابعة، وتأمين الجنين على ماصة عقد.

التركيز على pellucida زونا بحيث كل من الماصات وsspsocyst على نفس المستوى البؤري. التبديل إلى الهدف ليزر، ووضع مؤشر الليزر على pellucida زونا في الجانب الآخر من كتلة الخلية الداخلية. حفر pellucida زونا مع اثنين إلى ثلاثة نبضات الليزر، واضغط بلطف ماصة خزعة ضد pellucida زونا للسماح المتوسطة ليتم في مهب من خلال خرق لفصل الخلايا تروفكتديرم من السطح الداخلي.

عندما يتم فصل trophectoderm، أدخل من خلال ثقب وpirate سبعة إلى ثمانية الخلايا التروفيكتودرم في ماصة خزعة مع شفط لطيف. أثناء تطبيق شفط معتدل لتمتد الخلايا المستهدفة، قليلا تحريك ماصة خزعة إلى الوراء وتوجيه الليزر نحو أنحف جزء من الخلايا المستنشقة. إطلاق نبضات ليزر 2-5 عند تقاطعات بين الخلايا لفصل الخلايا المستهدفة من جسم الجنين.

عندما تم فصل جزء trophectoderm من الكيسة، والإفراج عن جزء في نفس قطرة خزعة بعيدا عن الكيسة لمنع جزء من امتص مرة أخرى في ماصة خزعة. الافراج عن الكيسة من الماصات عقد، ورفع على الفور كل من الماصات لمنع جزء من التمسك الماصات. ثم صورة جزء من الخزعة لأغراض مراقبة الجودة.

عندما تم خزعة جميع البلاستوسيست كما أظهرت للتو، نقل طبق الخزعة مرة أخرى إلى غطاء محرك التدفق الفاتنة وتسمية طبق ثقافة ما بعد الخزعة مع معرف الزوجين وكل قطرة مع معرفات الجنين ودورة. في وجود شاهد، شطف الكيسة في وسيط التلقيح الاصطناعي نظيفة ونقل الكيسة إلى انخفاض المقابلة لها في طبق ما بعد الخزعة. ثم ضع طبق ما بعد الخزعة إلى 37 درجة مئوية ، 6 ٪ ثاني أكسيد الكربون ، وحاضنة الأكسجين 5٪.

في وجود الشاهد وداخل غطاء محرك تدفق المفارق في درجة حرارة الغرفة، وتسمية أنابيب PCR مع علامة دائمة وغير سامة. تسمية غطاء من 60 × 15 ملليمتر حوض طبق ثقافة مع بطاقات العهون الجنين، وإضافة اثنين من قطرات 10 ميكرولتر من محلول غسل خزعة إلى الطبق. رئيس 140 ميكرومتر تجريد ماصة مع محلول غسل خزعة من قطرة الثانية من طبق الأنابيب تحت المجهر ستيريو لتصور شظايا trophectoderm.

الإفراج بلطف بعض محلول الغسيل خزعة على جزء trophectoderm، وتحميل جزء في ماصة تجريد. نقل جزء إلى قطرة ثانية من محلول غسل الخزعة، وشطف بعناية الأنسجة مرتين إلى ثلاث مرات. نقل جزء trophectoderm إلى الجزء السفلي من أنبوب PCR المسمى بشكل مناسب مع حل التحميل، مع الحرص على تجنب لمس جدران الأنبوب مع غيض من ماصة تجريد.

عندما يتم إضافة جميع الشظايا إلى أنابيبها، تدور جميع الأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لبضع ثوان لرواسب الشظايا. ثم تخزين العينات في ناقص 20 درجة مئوية حتى يتم شحنها إلى المختبر الوراثي الإحالة للاختبار. في غضون 30 دقيقة من خزعة التروستروم، تسمية لوحة التعبئة مع تفاصيل المريض و بطاقات من البلاستوسيست التي يجب أن تكون vitrified.

باستخدام كريولاbels الباردة المقاومة للحرارة الخاصة، تسمية يدعم vitrification مع اسم المريض ولقبه، معرف الزوجين، معرف الجنين الذي سيتم تحميلها على ذلك، وتاريخ الإجراء. في درجة حرارة الغرفة، الاستغناء 300 ميكرولترات من محلول التوازن لكل blastocyst التي سيتم vitrified و، في وجود شاهد، واستخدام ماصة تجريد 300 ميكرومتر لنقل الكيسة في حجم واحد من محلول التوازن. اترك الكيسة في محلول التوازن لمدة 13 إلى 15 دقيقة.

بعد انكماش أولي للحجم، سيتم ملاحظة إعادة التوسع التدريجي. في نهاية التوازن، إضافة 300 ميكرولترات من محلول التبريب إلى البئر الثاني من لوحة التبزج ونقل البلاستوسيست إعادة توسيع تماما إلى حل vitrification لمدة دقيقة واحدة. في نهاية الحضانة ، شطف الكيسة لتمييع محلول التوازن ، وفي وجود شاهد ، قم بتحميل الكيسة على دعم التبريب.

إزالة فائض من محلول الtrification. يجب أن يحيط فيلم دقيق من الحل بـ blastocyst. يغرق دعم الزج في النيتروجين السائل، ونقل بقوة الدعم للحد من خطر تشكيل فقاعة قريبة من العينة.

ثم ضع الغطاء الواقي على الدعم بينما لا يزال دعم التزجيج مغمورًا في النيتروجين السائل. من 1,544 إجراءات خزعة trophectoderm التي أجريت على مدى هذه الفترة التمثيل سنتين, ما بين واحد إلى أربعة الكيسات البلاستيك كانت خزعة لكل إجراء لمدة تتراوح بين ثلاث إلى 22 دقيقة لكل إجراء. في هذه المؤامرات، يتم عرض متوسط توقيت الخزعة لكل عامل على طول الثلث الدراسي، مع متوسط القيمة الإجمالية من 8.24 دقيقة.

ومن المفيد الحصول على صورة لكل جزء من الخزعات لأغراض مراقبة الجودة لتقييم ما إذا كان سبب التشخيصات غير الحاسمة يعزى إلى بُعد و/أو نوعية الشظية، أو إلى الأنابيب، أو إلى بعض المسائل المتعلقة بمعالجة العينة في المختبر الوراثي. في هذه الدراسة، تم تسخين 572 من البلاستوسيستات الولبية للخضوع لنقل الجنين بعد تشخيص الأوبلويدي. جميع البلاستوسيستات vitrified في غضون 30 دقيقة، مع 2.4٪ من الكيسات لا إعادة توسيع بين 31 و 90 دقيقة و 4.9٪ لا إعادة توسيع بعد 90 دقيقة من إعادة الدفء.

خاصة بالنسبة لسوء نوعية و / أو اليوم السابع من الكيسات ، يبدو التوقيت بين الخزعة والتزجيج أمرًا حاسمًا لتحقيق إعادة التوسع بعد الاحترار. الحرص على التركيز قبل فتح zona pellucida عند تعريض تقاطع بين خلية trophectoderm واطلاق النار، والحرص أيضا على منع blastocyst إعادة التوسع قبل vitrification. يوجد نهجان آخران من أساليب الخزعة البلاستكية، وكلاهما ينطوي على فتح زونا بيلوسيدا وانتظار تقوس عفوي من خلايا تروفكتوديرم.

وهذه النهج أسهل ولكنها تتطلب المزيد من التلاعبات وتستغرق وقتاً أطول. فعالية هذا العمل يسمح بتنفيذ التقنيات الجزيئية في التلقيح الاصطناعي من أجل محاولة لتحديد الكيسة مع أكبر فرصة لزرع قبل نقل الجنين. تذكر عدم استخدام أي جهاز أو حل قد يكون سامًا للأجنة ومنع تلوث الحمض النووي باستخدام مواد خالية من الحمض النووي.