بناء من CRISPR Plasmids والكشف عن كفاءة خروج المغلوب في خلايا الثدييات من خلال نظام مراسل Luciferase مزدوجة
ديسمبر 5, 2020
هنا، نقدم بروتوكول يصف طريقة مبسطة لتوليد كفاءة البلازميدات التعبير عن كل من الانزيم CRISPR ودليل واحد المرتبطة RNA (sgRNAs). co-transfection من خلايا الثدييات مع هذا الناقل sgRNA / CRISPR وseiferase مزدوجة لوسيفيراز مراسل الناقل الذي يدرس مزدوجة حبلا كسر إصلاح يسمح بتقييم كفاءة خروج المغلوب.
يصف هذا البروتوكول الخطوات الرئيسية في توليد وتعظيم كفاءة ناقلات sgRNA. إن سعينا قبل أن نُعد المرشح SgRNA يستهدف الوقت والاستدلال النسبيين. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه يجعل من الممكن لتحليل الانطباعات الترميز الحمض النووي لكل من sgRNAs دون تحرير الجينات الذاتية.
ويمكن أيضا تطبيق طريقة الاختيار المسبق هذه على تدابير تحرير الجينات الأخرى من خلال فترات الراحة المزدوجة. تبدأ عن طريق تخفيف oligonucleotides مبيد البيدوغين إلى تركيز نهائي من 10 ميكرومولار في الماء المقطر مزدوجة. تخلط إلى الأمام وعكس oligonucleotides في أنبوب PCR رقيقة الجدران بنسبة واحد إلى واحد دون إضافة أي عازلة إضافية.
احتضان الخليط في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم منحدر إلى أسفل درجة الحرارة إلى 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة مزيج oligonucleotide من آلة PCR والسماح لها لتبرد في درجة حرارة الغرفة. هضم متجه pX330-xCas9، مع Bbs1، والجمع بين الناقل والانزيم، ومخزن الهضم في حجم 50 ميكرولتر واحتضان رد الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد إجراء تحويل الخلايا، واختيار خمسة إلى 10 مستعمرات بكتيرية من لوحة LB واستخدام كل واحد منهم لتطعيم ملليلتر واحد من وسائل الإعلام LB مع 60 ملليغرام أمبيسيلين في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم احتضان الأنابيب على شاكر دوار لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. قم بإجراء PCR لفحص البلازميدات المؤتلفة كما هو موضح في مخطوطة النص، ثم قم بتشغيل المنتجات على جل Agarose بنسبة 2٪تحت 10 فولت لكل سنتيمتر.
بعد تحديد البلازميدات الإيجابية ، واستخدامها ، جنبا إلى جنب مع ناقل مراسل ، للمشاركة في نقل خط الخلية المناسبة. لlyse الخلايا، وإزالة المتوسطة النمو من الخلايا المستنمَد. غسل بلطف سطح السفينة الثقافة مع برنامج تلفزيوني والاستغناء 100 ميكرولتر من PLB في كل ثقافة بشكل جيد لتغطية طبقة الخلية أحادية تماما.
اترك الطبق يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، ثم انقل اللساتية إلى أنبوب أو قارورة لمزيد من المناولة أو التخزين. لتنفيذ مقايسة لوسيفراز المزدوجة، قم ببرمجة المقاييس المضيئة لتوفير تأخير ما قبل القراءة الثانيين متبوعاً بفترة قياس 10 ثوانٍ. ثم، الاستغناء 100 ميكرولترات من مُسايس luciferase الكاشف في العدد المناسب من أنابيب المضيء.
إضافة بعناية 20 ميكرولترات من الخلية lysate في أنبوب مضيئة ومزيج عن طريق الأنابيب مرتين أو ثلاث مرات. ضع الأنبوب في المضيء وابدأ القراءة. إزالة أنبوب عينة من مضيئة.
إضافة 100 ميكرولترات من الكاشف وقف ودوة لفترة وجيزة لخلط. أرجع العينة إلى مقياس الإضاءة وابدأ القراءة. سجل نشاط رينيها لوسيفراز، تطبيع إلى نشاط لوسيفراز اليرا، وتحديدا تبادل النسبة المعروضة على الشاشة.
تخلص من أنبوب التفاعل عند الانتهاء. وقد استخدمت هذه الطريقة لتوليد ثلاثة ناقلات sgRNA للأغنام DKK2 إكسون 1. تم بناء ناقلات sgRNA وxCas9 المعبرة عن ذلك عن طريق هضم العمود الفقري للمتجهات متبوعة بربطها في سلسلة من شظايا الحمض النووي قصيرة مزدوجة حبلا من خلال أزواج القلة.
تم فحص سبع مستعمرات بكتيرية مع زوج التمهيدي محددة موجهة PCR واكتشفت المستعمرات الإيجابية. تم الكشف عن قدرات استهداف الجينات pX330-xCas9 T1 و T2 و T3 في وقت واحد مع مقايسة لوسيفيراز المزدوجة. وعرض آخر متجه من SgRNA أعلى إشارة الكشف واستخدم فيما بعد في أبحاث تحرير جينات الأغنام.
بعد هذا البروتوكول، يمكن إجراء فحص T7EI أو مقايسة ريبونوكلي. هذه التدابير الإضافية تعطي انطباعات أكثر دقة عن تحرير الجينات الذاتية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لتوليد البلازميدات التي تعبر عن إنزيم CRISPR وRNA الموجه الفردي المرتبط (sgRNAs). يتيح ذلك تقييم كفاءة القصور من خلال التحول المشترك مع ناقل مراسل luciferase مزدوج.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تحرير الجينات
- تقنية CRISPR
- بناء البلازميد
الخلفية
- إن التوليد الفعّال لنواقل sgRNA أمر حاسم لتحرير الجينات.
- يُمكّن البروتوكول تحليل انطباعات ترميز الحمض النووي دون تعديل الجينات الذاتية.
- يمكن أن يؤدي الاختيار المسبق لأهداف sgRNA إلى تعزيز كفاءة التحرير.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على تدابير تحرير الجينات المختلفة.
هدف الدراسة
- توفير بروتوكول لتوليد نواقل sgRNA فعّالة.
- تسهيل تحليل فعالية sgRNA في تحرير الجينات.
- تبسيط عملية تقييم كفاءة القصور.
الطرق المستخدمة
- تخفيف الأوليجو نيوكليوتيدات المجففة بالتبريد إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومولار.
- خلط الأوليجو نيوكليوتيدات الأمامية والخلفية في أنبوب PCR.
- التحول المشترك للخلايا الثديية مع ناقل sgRNA/CRISPR وناقل المراسل.
- تقييم كفاءة إصلاح كسر المزدوج الحبل.
النتائج الرئيسية
- يتيح البروتوكول توليدًا فعّالاً لنواقل sgRNA.
- يمكن تقييم كفاءة القصور بشكل فعّال.
- يعزز الاختيار المسبق لأهداف sgRNA عملية التحرير.
- يمكن تطبيق الطريقة على استراتيجيات تحرير الجينات الأخرى.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لتوليد نواقل sgRNA.
- يسهل تحليل تحرير الجينات دون تعديل الجينات الذاتية.
- يمكن تعديل الطريقة لمختلف التطبيقات في تحرير الجينات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient sgRNA vector construction and rapid knockout efficiency assessment are critical for accelerating CRISPR-based target validation in early discovery pipelines. The dual luciferase reporter system enables quantitative, pre-endogenous screening of candidate sgRNAs, reducing time and resource expenditure before full-scale gene editing. This workflow supports portfolio triage by prioritizing sgRNAs with the highest editing potential for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid preselection of sgRNAs with high editing efficiency before endogenous gene targeting.
- Supports functional target validation by quantifying double-strand break repair via reporter assays.
- Reduces mechanistic ambiguity by isolating sgRNA performance in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in CRISPR reagent selection for subsequent studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative readout for sgRNA activity using dual luciferase ratios.
- Improves assay reproducibility and comparability across candidate sgRNAs.
- Enables scalable screening of multiple sgRNA constructs in parallel.
- Prepares validated sgRNA/CRISPR vectors for downstream gene editing workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sgRNA selection with translational goals by ensuring only high-efficiency reagents advance.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by minimizing failed edits in disease-relevant models.
- De-risks preclinical studies by front-loading sgRNA efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling efficient sgRNA selection prior to endogenous gene editing and downstream functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling rapid sgRNA efficacy screening.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible luciferase-based outputs for sgRNA comparison.
- Analytics: Provides normalized dual luciferase ratios to objectively rank sgRNA performance.
- Translational Research: Ensures only validated, high-performing sgRNAs progress to disease-relevant or preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for sgRNA validation across multiple gene targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in CRISPR reagent selection.
- Operational Value: Standardizes sgRNA screening and accelerates vector construction timelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by prioritizing high-efficiency sgRNAs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage failure due to ineffective gene editing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell transfection, and luciferase assay execution.
- Needs access to PCR, gel electrophoresis, and luminometer instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data normalization.
- Adaptable to various mammalian cell lines and gene targets with appropriate optimization.
- Dependent on accurate oligonucleotide design and vector preparation for reproducible results.
