في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

وبهدف الحد من اختبار الحيوانات وبسبب تغير اختبار NH، تشجع منظمة الصحة العالمية على تطوير نُهج في المختبر لتقييم فعالية لقاح داء الكلب. هذا الاختبار ELISA يظهر التوافق جيدة مع اختبار NH الكلاسيكية في التعرف على شكل مناعي من الجليكوبروتين، ويظهر حساسية عالية، ويمكن أن يؤديها في غضون يوم واحد فقط. تقييم قوة لقاح داء الكلب في المختبر من قبل ELISA هو بديل لاختبار NH في الجسم الحي.

يتم الترويج لها من قبل المصنعين ومختبرات الرقابة الوطنية. من المهم توزيع وحدات تخزين مسبقة الحجم في نسخة مكررة لكل تخفيف وتجفيف البئر على لوحة على الورق ماصة بعد يغسل لتجنب لبدء هذا الإجراء، وضعت على معدات الحماية الشخصية بما في ذلك معطف المتاح، والقفازات، قناع، والنظارات. علاج المواد الملوثة عن طريق غمره في محلول من 2.6 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 30 دقيقة لإزالة التلوث.

بعد ذلك ، حدد لوحة 96 مناعيًا جيدًا وأضف 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المخففة في المخزن المؤقت للكربونات إلى كل بئر. غطي الطبق بطبق لاصق ويحضن اللوح الصغير على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات في بيئة مرطبة. ثم الطامح بعناية ونقل محتوى البئر إلى المتلقي التي تحتوي على محلول من 2.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم.

عكس اللوحة الدقيقة واتركها تجف على الورق الماص في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أولاً، إضافة 300 ميكرولترات من عازلة التخميل إلى كل بئر. غطي الطبق بالأفلام اللاصقة ويحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، نقل محتويات البئر إلى واحد يحتوي على محلول من 2.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم. لغسل لوحة، إضافة 300 ميكرولترات من العازلة الغسيل إلى كل بئر. ثم الطامح بعناية ونقل محتوى البئر إلى المتلقي التي تحتوي على حل من 2.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم.

كرر عملية الغسيل هذه خمس مرات أخرى لغسل على نطاق واسع لوحة حساس. بعد ذلك، عكس اللوحة الدقيقة واتركها تجف على قطعة من الورق الماص في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. إعادة تركيب اللقاح المرجعي في مليلتر واحد من الماء المقطر بحيث يكون التركيز النهائي لفيروس داء الكلب glycoprotein هو 10 ميكروغرام لكل ملليلتر.

إعداد تخفيف 10 أضعاف من لقاح المرجعية المعاد تشكيلها في diluent للوصول إلى فيروس داء الكلب تركيز الجليكوبروتين من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر. بعد ذلك، قم بإجراء ستة عمليات تخفيف متسلسلة ذات شقين لهذا اللقاح المرجعي في المذال كما هو موضح في الجدول الأول من بروتوكول النص. توزيع 200 ميكرولتر من الم المسكن في آبار مكررة لتكون بمثابة سيطرة عمياء و200 ميكرولتر في البئر لكل تخفيف لقاح مرجعي مكرر.

ثم إعداد تخفيف 10 أضعاف من اللقاح اختبارها في الملوين وإعداد سبعة شقين التخفيف المسلسل من اللقاح اختبار في مخفف كما هو مبين في الجدول الثاني من بروتوكول النص. توزيع 200 ميكرولترات من كل تخفيف لقاح مختبر في نسخ مكررة لكل بئر من الألواح الدقيقة. غطي اللوح الصغير بالأفلام اللاصقة ويحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، قم بإزالة الفيلم. التعرق بعناية ونقل محتويات كل بئر إلى مستلم يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم 2.7٪. لغسل لوحة، إضافة 300 ميكرولترات من الغسيل العازلة إلى كل بئر، التعرق بعناية ونقل محتويات كل بئر إلى المتلقي التي تحتوي على 2.6٪ حل هيبوكلوريت الصوديوم.

كرر عملية الغسيل خمس مرات أخرى لإزالة المستضد غير منضم والحفاظ على الزخارف G-البروتين ملزمة إلى الأجسام المضادة المغلفة. عكس microplate غسلها والسماح لها الجافة على قطعة من الورق الماص في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. ثم توزيع 200 ميكرولترات من التخفيف الموصى بها من بيروكسيديز المسمى D1 الأجسام المضادة أحادية النسيلة في diluent إلى كل بئر.

غطي اللوح الصغير بالأفلام اللاصقة ويحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، إزالة الفيلم، وpirate بعناية، ونقل محتويات كل بئر إلى المتلقي التي تحتوي على 2.6٪ حل هيبوكلوريت الصوديوم. لغسل microplate، إضافة 300 ميكرولترات الغسيل العازلة إلى كل بئر.

التعرق بعناية ونقل محتويات كل بئر إلى المتلقي التي تحتوي على 2.6٪ حل هيبوكلوريت الصوديوم. كرر عملية الغسيل هذه خمس مرات أخرى لإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة من البيروكسيديز. عكس microplate غسلها والسماح لها الجافة على قطعة من الورق الماص في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

المقبل، وتوزيع 200 ميكرولترات من محلول الركيزة-الكروموجين في كل بئر. ختم microplate مع فيلم واحتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة 50 ميكرولتررس من وقف الحل في كل بئر لوقف رد الفعل.

مسح بعناية الجزء السفلي من microplate ووضعها في مطياف. تحديد الكثافة البصرية عند 492 نانومتر لجميع الآبار المستخدمة. جمع هذه البيانات في ملف جدول بيانات للتحليل.

بعد ذلك، قم بإنشاء مخططات لكل من منحنى اللقاح المرجعي وقيم الكثافة البصرية كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يتم استخدام اختبار ELISA في المختبر لتقييم قوة لقاح داء الكلب. تظهر هنا قيم الكثافة البصرية التمثيلية من تجربة نموذجية.

وتستخدم هذه القيم لرسم منحنى اللقاح المرجعي عن طريق رسم متوسط الكثافة البصرية للتخفيفات المختلفة من اللقاح المرجعي على المحور الرأسي وتركيز بروتين الجليكوبروتين على المحور الأفقي. ثم يُقدَّر محتوى بروتين الجليكوبروتين في اللقاح المختبر باستخدام هذا المنحنى. والتقييم دقيق بالنسبة للتخفيفات التي لها قيمة متوسطة للكثافة البصرية في منطقة الخطوط الملاحية المنتظمة من منحنى اللقاح المرجعي.

ومع مراعاة تخفيف واحد إلى 40، فإن الإسقاط الرأسي لـ OD 1534 على المحور x يقابل 500 نانوغرام لكل ملليلتر. لذلك يقدر اللقاح المختبر بـ 20 ميكروغرام لكل ملليلتر من بروتين الجليكوبروتين. وعند إثبات الفعالية في المختبر، من الضروري مقارنة اللقاح المختبر بالمعيار المرجعي 6 معايير منظمة الصحة العالمية الدولية التي تم معايرتها في وحدات دولية.

ويمكن استخدام نفس الطريقة مع الأجسام المضادة الأخرى لتوسيع نطاق الكشف عن المزيد من سلالات اللقاحات بما في ذلك تلك المستخدمة في اللقاحات البيطرية التي هي عادة أكثر متغيرة. ويمكن أيضا أن تستخدم الأجسام المضادة في المنافسة على المعايرة من الأجسام المضادة للاعتدادات في الخيول أو مصل الإنسان. يجب اتخاذ الاحتياطات مع اللقاحات التي لم يتم تعطيلها أو مع الفيروسات.

تأكد من استخدام معدات الحماية الشخصية وارتداء القفازات وإزالة التلوث بشكل صحيح. أيضا، كن حذرا مع أقراص من كما هي مسرطنة ومع محلول هيبوكلوريت الصوديوم الحمضية.