استخدام مجهرية القوة الذرية لقياس الخصائص الميكانيكية وضغط التورغور للخلايا النباتية والأنسجة النباتية

الخصائص الميكانيكية للخلايا النباتية ضرورية يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند محاولة فهم الآليات الكامنة في التنمية. يمكن استخدام المجهر القوة الذرية لقياس هذه الخصائص، واتباع الطريقة التي تتغير، بين الأجهزة والأنسجة، وجميع مراحل النمو. المزايا الرئيسية لهذه التقنية، هو أنه لا شيء الغازية، وأنها سريعة نسبيا وأنها لا تتطلب العلاج بحيث يمكن تطبيقها مباشرة على عينات المعيشة.

بالنسبة لشخص جديد على هذا الإجراء، قسم رابطة الدول المستقلة من العينة أمر بالغ الأهمية حقا، لذلك تأكد من أن لديك حقا تثبيت الميكانيكية المناسبة للعينة. المرئية مظاهرة من هذا الإجراء، أمر بالغ الأهمية لفهم أفضل تعقيدات تثبيت العينة، ومراقبة الجودة من يعزز والإعداد القياس. إثبات الإجراء سيكون سيمون بوفيو، مهندس ويوخين لونغ، طبيب آخر في مختبري.

للبدء، ضع قطعة من الشريط من جانبين في وسط من خمسة سنتيمترات قطرها بتري طبق. إضافة عينة من genesium التي تم عزلها من برعم زهرة إلى الشريط. أضيفي الماء بسرعة إلى الطبق حتى يتم تغطية العينة بالكامل لتجنب الجفاف.

بعد ذلك، ضع العينة على مرحلة AFM وتحريك الرأس بحيث يكون فوق العينة. بعد معايرة cantilever ، في البرنامج ، تأكد من أن النظام في وضع QI ، والاقتراب من العينة مع قوة نقطة محددة من خمسة عشر نانو نيوتن. بعد ذلك ، قم بتعيين طول Z من أربعة ميكرون وتعيين منطقة المسح الضوئي إلى ثمانين ميكرون من قبل مربع مع عدد من بكسل تعيين إلى أربعين من قبل أربعين.

ثم انتقل إلى لوحة إعدادات التصوير المتقدمة وقم بتعيين الوضع إلى سرعة ثابتة. بالإضافة إلى ذلك، تعيين تمديد دخول سرعة المسار إلى مائتي ميكرون في الثانية الواحدة، ومعدل العينة إلى 25 كيلو هيرتز. بمجرد تعيين المعلمات، قم بنقل الطرف إلى المنطقة التي تهمك في العينة.

تحقق من أن المنطقة المراد مسحها خالية من الحطام، وحدد موقع منطقة مسطحة قدر الإمكان، واشتبك، ثم ابدأ المسح الضوئي واستخدم المسح السريع للقوة المنخفضة للتحقق مما إذا كانت العينة تتحرك. مرة واحدة في منطقة الاهتمام كما تم تحديدها، حدد المنطقة التي هي أربعين من قبل أربعين إلى ستين من قبل 60 ميكرون مربعة، وزيادة عدد بكسل إلى اثنين بكسل لكل ميكرون. المقبل ، وزيادة نقطة مجموعة إلى خمسمائة نانو نيوتن ، للحصول على المسافة البادئة من مائة إلى 200 متر نانو.

إنقاص طول Z إلى اثنين من ميكرون، وتمتد دخول سرعة المسالك إلى مائة ميكرون في الثانية الواحدة، ثم زيادة معدل العينة إلى 50 كيلوهيرتز، والبدء في مسح العينة. عند الانتهاء، احفظ الإخراج كصورة وملف بيانات. افتح برنامج معالجة البيانات وحمّل ملف البيانات.

انقر على استخدام هذه الخريطة لدفعة معالجة زر من أجل استخدام نفس المعلمات على جميع منحنيات من الخريطة، ثم انتقل إلى تحميل عملية محددة مسبقا وحدد هرتز تناسب. بعد ذلك، انتقل إلى عملية خط أساسي قابل للتبديل، وتعيين طرح لإزاحة زائد إمالة، وX دقيقة بين الأربعين وستين بالمائة. في علامة التبويب موضع التلميح العمودي، حدد على وضع ضيق، إذا كنت تفضل العمل على البيانات الأولية.

لتحديد طراز الملائمة المناسبة، انتقل إلى علامة التبويب ملائمة المرونة، وحدد أحد الخيارات استنادًا إلى قوة التصاق المتوقعة. إذا كان هناك أي التصاق ضعيف أو موجودة، ثم استخدام منحنى النهج ويفضل استخدام نموذج isnader هرتز. في حالة التصاق أقوى، استخدم نموذج ديرغن ميليا دورتوبروف أو DMD والعمل على منحنى متخلف.

الآن تعيين المعلمات الطرف هندسية على أساس شكل تلميح الاسمية. الطرف المستخدم في هذه التجربة هو طرف كروي، مع نصف قطره 400 متر نانو. بعد ذلك، قم بتعيين نسبة Poisson إلى 0.5، وحدد منحنيات النوبات.

إضافة روتين تناسب مرونة ثانية، من خلال النقر على أيقونة من النافذة الرئيسية، وتكرار إعدادات المعلمة نفسها. وأخيراً، حدد المسافة البادئة المطلوبة في x دقيقة ثم الاحتفاظ بها وتطبيقها على الجميع تكرار الخطوات السابقة على جميع منحنيات الخريطة. حفظ النتائج للحصول على صورة في ملف tsv نقطة.

لقياس مع التغيرات حل سريع، جبل عينة في طبق بتري، عقد قطعة صغيرة من المصطك اللاصق. بسرعة سد الفجوة بين قاعدة العينة والمصطكي مع الغراء compatible. انتظر الغراء لترسيخ ثم غمر العينة في سائل قمة ثقافة المتوسطة، التي تحتوي على 0.1 في المئة مزيج الحفاظ على النبات.

بعد معايرة النظام، افتح برنامج الاستحواذ واذهب أولاً إلى نافذة معلمة الاختيار. هناك تعيين ثابت الربيع إلى ثابت الربيع المصنعة كانتيليفر أو ثابت الربيع المحدد. بعد ذلك ، تعيين نصف قطرها تلميح إلى أربعمائة متر نانو ، ونسبة poisson عينة إلى 0.5 ، وخط العينة إلى مائة وثمانية وعشرين لضمان الحصول السريع ، ومعدل المسح الضوئي إلى 0.2 هيرتز وحجم المسح الضوئي إلى ميكرون واحد.

ثم انتقل إلى نافذة المنحدر وتعيين حجم المنحدر إلى خمسة ميكرون، عتبة المثلثات إلى الحد الأقصى، وعدد العينات إلى أربعة آلاف ستمائة وثمانية. مع كل من مجموعة المعلمات ، بعناية نهج العينة يدويا. عندما يكون المسبار قريبًا نسبيًا من سطح العينة ، انقر على النهج.

عند الاتصال، قم بزيادة حجم المسح الضوئي تدريجياً وتعديل معدل المسح الضوئي، حتى يتم الوصول إلى التوازن المطلوب دون الإضرار بالعينة أو الطرف. نقل المسح إذا منطقة القياس غير مرغوب فيه. عندما راض، انقر فوق الزر، نقطة واطلاق النار، لبدء نقطة ونافذة تبادل لاطلاق النار.

تحديد دليل حفظ واسم ملف. ثم انقر على منحدر على الفحص التالي لبدء التسجيل. عند اكتمال الفحص، سيتم إعادة توجيه واجهة البرنامج إلى نافذة المنحدر.

انقر على الصورة الممسوحة ضوئيًا لتحديد المواضع المراد وضعها. اختيار ما لا يقل عن ثلاثة مشاهد المسافة البادئة لكل خلية بالقرب من مركز التوت انها، تعيينها لتكرار المسافة البادئة ثلاث مرات لكل جانب، ثم انقر فوق منحدر والتقاط. في برنامج التحليل، افتح ملف DOT MCA، وهذا يظهر موضع كل منحنى قوة على الصورة الممسوحة ضوئيًا.

ثم فتح منحنى قوة واحدة لتحليلها. انقر فوق زر تصحيح الخط الأساسي واسحب خطوط الشرطة الزرقاء على منحنى القوة، حتى يتم تمديد خط الأساس المصدر بدءًا وتمديد خط الأساس المصدر، أو عند 0 بالمائة و80 بالمائة على التوالي. ثم انقر على تنفيذ.

بعد ذلك انقر فوق زر تصفية السيارة مربع، وانقر فوق تنفيذ لتنعيم منحنى القوة. ثم انقر فوق زر المسافة البادئة. في إطار الإدخال، قم بتعيين المنحنى النشط إلى توسيع، والأسلوب الخامس إلى النموذج الخطي، والحد الأقصى لاحتواء الحد إلى 99 بالمائة، وقوة الحد الأدنى لـ 75 بالمائة، ونموذج الملاءمة لصلابة.

تحليل منحنيات القوة في دفعة. لتنفيذ ذلك، انقر فوق زر محفوظات التشغيل، وحدد دليل التقرير، ثم أضف منحنيات القوة الأخرى التي تتطلب نفس المعاملة. عند الانتهاء، انقر فوق تشغيل.

عندما تكون القيمة K هي مجموعة تركيبها، انقر فوق المحفوظات ثم انتقل إلى مسافة بادئة خمسة للعودة إلى إطار المسافة البادئة. مرة واحدة هناك، تغيير الحد الأقصى للقوة تناسب عشرة في المئة و min قوة تناسب الحدود إلى واحد في المئة. ثم تعيين نموذج تناسب إلى Hertzian.

بعد ذلك، افتح الملف المناسب لعرض القنوات الممسوحة ضوئيًا المختلفة. في نافذة القناة العالية، انقر على زر القسم. وهذا سيسمح بقياس انحناء سطح العينة المطلوب لخصم ضغط التورغور.

ثم ارسم خطاً عبر المحور الطويل لخلية واحدة، حرك حدود خط الشرطة إلى حواف الخلية وسجل قيمة نصف القطر. أخيرا اتبع على طول في بروتوكول النص، لحساب معامل الشباب المتوسط، ثابت الربيع، E، K، وضغط تورغور لكل خلية. الصورة على اليسار هي خريطة معامل الشباب، التي تم الحصول عليها من خلال تحليل المسافة البادئة كله يصل إلى نقطة مجموعة قوة محددة من المستخدم في حين أن الصورة على اليمين، ويبين نتيجة تحليل أول مائة متر نانو المسافة البادئة.

هنا، تبدو الخريطتان متشابهتين للغاية، ولكن الاختلاف في عمق المسافة البادئة يمكن أن يؤدي في بعض الحالات إلى تمييز أفضل لـ "التغايرات العينة"، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد الموقع أو لتوفير معلومات حول سلوك الهياكل الداخلية. لكل نقطة على هذه الخرائط، هناك منحنى القوة الكامنة. المنحنى هو مبين هنا، وقد اثنين من الآثار التي تستحق الذكر.

أولاً، إذا كان جزء النهج من منحنى القوة ينتهي عند خمسمائة نانو نيوتن. حركة البقشيش الهبوطي تستمر. يعني القوة النهائية المطبقة من قبل طرف أعلى من المتوقع.

الشيء الثاني أن يلاحظ، هو موجة في على منحنى تراجع سلط الضوء عليها القطع الناقص. قد يكون هذا التلويح مؤشرا على عينة تتحرك أو تهتز تحت عمل تلميح والتحول إلى طريقة تثبيت مختلفة قد تكون مطلوبة. باستخدام الإجراء الموثق في هذه المقالة، يمكن استرجاع كافة المعلمات الرئيسية لخصم ضغط تورغور باستثناء سماكة جدار الخلية من مسح AFM والمسافات البادئة.

يصف منحنى القوة من المسافة البادئة العميقة في موقف الصليب الأحمر معامل جدار الخلية الشابة وصلابة العينة الظاهرة في أنظمة مختلفة من المنحنى. تثبيت العينة أمر بالغ الأهمية. خلال عملية القياس، إيلاء الاهتمام لعلامات عدم الاستقرار العينة.

اختر بعناية منطقة ذات سطح مستوٍ لضمان المسافة البادئة العمودية. بعد هذا الإجراء، يمكن للمرء أن يراقب الخواص الميكانيكية مع مرور الوقت وظروف مختلفة. يمكن للمرء أيضا تراكب القياسات الميكانيكية مع الصور confocal لدراسات مترابطة.

وتمهد هذه التقنية الطريق لربط الميكانيكا الحيوية مع تطوير علم وظائف الأعضاء والعمليات البيولوجية الأخرى.