تسجيل بصري ذو صورة واحدة في شرائح الدماغ باستخدام صبغ حساس للجهد الكهربائي
يونيو 20, 2019
نحن نقدم طريقة تسجيل بصري قابل للتكرار ومستقرة لشرائح الدماغ باستخدام صبغة حساسة للجهد. تصف المقالة تلطيخ الصبغة الحساسة للجهد الكهربائي وتسجيل الإشارات البصرية باستخدام الاستعدادات التقليدية لشريحة الحصين.
ويعتقد أن طريقة التسجيل البصري مع صبغة حساسة الجهد لتكون التكنولوجيا المثالية لتصور كيف يعمل الدماغ. هذه الطريقة سمحت لنا لتسجيل ديناميات العصبية النفسية بشكل مستقر وموثوق به أكثر من 12 ساعة، نظرا لنا وجهة نظر على النشاط النفسي. نحن نحاول توسيع نطاق التطبيق للكشف عن التغيرات الدائرة الناجمة عن المواد الكيميائية على جميع مراحل التنمية، مثل تطبيق حمض قيمة للأمهات.
هذه التقنية راسخة بالفعل. يرجى محاولة إعادة إنتاج الدراسات باتباع الطريقة المعروضة هنا. لبدء هذا الإجراء، غمر الرأس مقطوعة الرأس في الجليد البارد ACSF في علبة جراحية الفولاذ المقاوم للصدأ.
استخراج الدماغ في غضون دقيقة واحدة ووضعها في منقار يحتوي على ACSF المبردة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بتقسيم قسم الدماغ في خط الوسط بمشرط ووضع كلا نصفي الكرة الأرضية على كتلة أجار بنسبة 4٪. ثم، ضع كتلة الدماغ مع كل نصفي الكرة الأرضية على كتلة أجار 4٪.
امسح ACSF الزائد من الكتلة بورقة تصفية. في وقت لاحق، وتطبيق superglue على منصة هزاز. ضع كتلة agar عليها وامسح لاصقة المفرطة مع ورقة مرشح.
تطبيق بلطف كمية صغيرة من الجليد البارد ACSF من الجزء العلوي من كتلة أجار الدماغ للمساعدة في ترسيخ superglue الزائدة ومنع الغراء من تغطية الدماغ وإزعاج تشريح. بعد ذلك، قم بإصلاح المنصة إلى صينية الاهتزاز وصب ACSF المعدلة. تعيين هزاز إلى سرعة بطيئة ويكون تردد شفرة في الإعداد الأقصى.
ثم ابدأ في التقطيع. ضع الشرائح في زاوية غرفة الشريحة بالتسلسل بحيث يمكن تمييز ترتيب الشرائح بسهولة. وعادة ما يمكن الحصول على ثلاث إلى خمس شرائح من نصف الكرة الأرضية واحد.
بعد ذلك، قطع جزء جذع الدماغ باستخدام إبرة قياس 30. باستخدام فرشاة طلاء صغيرة، ضع الشريحة على مرشح الغشاء الذي يحمله خاتم زجاج شبكي. ضع الخاتم في غرفة استرداد رطبة واضمن الغطاء للحفاظ على الضغط الداخلي مرتفعًا.
عند وضع الشريحة على مرشح الغشاء، ضبط اتجاه وموقف شريحة داخل حلقة لضمان أن يكون مركزها بشكل جيد ولها اتجاه ثابت. اترك العينة عند درجة 28 مئوية لمدة 30 دقيقة ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 30 دقيقة على الأقل للتعافي. لطخة الشرائح، وتطبيق بلطف 100 ميكرولترات من حل تلطيخ على كل شريحة واحتضان في 20 دقيقة لدرجة حرارة الغرفة.
المقبل، وإعداد 50 إلى 100 ملليلتر من ACSF في حاوية. ضع الخاتم مع العينة فيه لشطف محلول التلطخ. ثم، نقل شرائح مشطف إلى غرفة حضانة أخرى.
انتظر أكثر من ساعة واحدة للتعافي قبل التجربة. لبدء هذا الإجراء، قم بتشغيل مكبر الصوت والكمبيوتر ونظام الكاميرا وافتح البرنامج. صب ACSF في أنبوب 50 ملليلتر وفقاعات مع كاربوجين.
استخدام مضخة ال peristaltic لتعميم ACSF وضبط معدل التدفق إلى ما يقرب من ملليلتر في الدقيقة الواحدة. ثم، ضبط ارتفاع ماصة الشفط بحيث مستوى السائل داخل غرفة التجربة هو ثابت دائما. ضع القطب الأرضي في الغرفة.
في وقت لاحق، تعبئة القطب الزجاجي مع كمية صغيرة من ACSF ووضعها في حامل القطب. إرفاق حامل لقضيب المتلاعب. باستخدام مكبر للصوت، تأكد من أن مقاومة القطب الكهربائي هو ما يقرب من ميجام.
في جلسة التسجيل، قم بنقل شريحة من الغرفة الرطبة إلى غرفة تجريبية. اضغط على حافة الحلبة بقوة في سيليكون س- حلقة. يجب الحرص على عدم كسر الغشاء أو الجزء السفلي من غرفة التجربة.
تحت المجهر مكان غيض من القطب المحفزة وأقطاب تسجيل حقل ممكن على شريحة. تحقق من الاستجابة التي أثارتها من خلال تقديم حافز. تأكد من أن مجال الرؤية يغطي الدائرة العصبية الصحيحة في نظام التسجيل البصري.
بعد ذلك، ضبط شدة ضوء الإثارة إلى ما يقرب من 70 إلى 80٪ من القدرة القصوى في الكاميرا. باستخدام مصدر الضوء الفلورسنت، ضبط التركيز مع نظام الامتلاك. ثم، بدء التسجيل وتحليل البيانات في برنامج الحصول على صورة بعد الاستحواذ.
هذا الرقم يظهر إشارة بصرية تمثيلية على التحفيز الكهربائي من collaterol شيفر في منطقة CA1 من شريحة فرس النهر الماوس. وتظهر هذه الصور المتتالية الإشارة البصرية قبل أن يتم تطبيق أي مرشحات سفبية وزمنية بينما تظهر هذه الصور نفس البيانات بعد تطبيق خمسة في خمسة مرشح مكعب مرتين. بسبب ارتفاع معدل الإطار ودقة المكانية العالية ، فإن تطبيق المرشح لم يغير الإشارة ، ولكن تمت تصفيتها من الضوضاء التي يمكن ملاحظتها أيضًا في الدورة الزمنية المسجلة بالبكسل في تجربة واحدة.
هنا مقارنة الاستجابات النموذجية في منطقة CA1 من شرائح فرس النهر بين الفأر والجرذ. لوحظت الاستجابة الصغيرة لفرط الأقطاب في الجانب القعد من CA1 بعد 24 مللي ثانية في شريحة فرس النهر للماوس ، ولكن استجابة أكثر ضخامة للأقطاب تجاوزت الاستجابة المزيلة في شريحة فرس النهر الفئران. مرة واحدة هي ملطخة شرائح، ينبغي أن تستمر لأكثر من 12 ساعة ويمكنك إجراء التسجيلات الكهربائية الأخرى عليها.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة تسجيل بصري مستقرة باستخدام صبغة حساسة للجهد لشرائح الدماغ، مع التركيز على إشارات العصبونات في الحصين. توفر هذه التقنية رؤية موثوقة للديناميكيات العصبية النفسية على فترات زمنية ممتدة، مما يسهل استقصاء التغيرات في الدوائر العصبية الناتجة عن التطبيقات الكيميائية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علوم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربائية
- التصوير البصري
خلفية علمية
- تُعد الصبغة الحساسة للجهد ضرورية لتصوير أنشطة الدماغ.
- تُستخدم تحضيرات شرائح الحصين التقليدية كنموذج بيولوجي.
- تستكشف الدراسة الديناميكيات النفسية العصبية وتغيرات الدوائر.
- افتقرت الطرق السابقة إلى الموثوقية خلال فترات التسجيل الممتدة.
الغرض من الدراسة
- تقديم طريقة قابلة للتكرار للتسجيل البصري في شرائح الدماغ.
- توفير رؤى حول تأثيرات المواد الكيميائية على ديناميكيات الدوائر الدماغية.
- تمكين المراقبة طويلة الأمد للنشاط والاستجابات العصبونية.
الطرق المستخدمة
- المنصة المستخدمة هي شرائح دماغية خارج الجسم (ex vivo) مُعدة من حصين الفأر.
- يتضمن النموذج الرئيسي شرائح الحصين، مما يسهل الدراسات المتعلقة بالنشاط الكهربائي.
- لم يتم ذكر أي مسارات عمل لعلوم الأوميكس المتعددة (multiomics)؛ حيث ينصب التركيز على التقنيات البصرية والفيزيولوجيا الكهربائية.
- تتضمن عملية التحضير خطوات دقيقة مثل التبريد، والصبغ، وحضانة الشرائح.
- تُجرى جلسات التسجيل في غرفة تجريبية تتطلب إعدادات دقيقة.
النتائج الرئيسية
- تتيح الطريقة البصرية جمع بيانات موثوقة على مدار فترة زمنية مدتها 12 ساعة.
- تظهر مقارنة الاستجابات بين شرائح حصين الفأر والجرذ ملامح فيزيولوجية عصبية متمايزة.
- تتأكد التغيرات الفيزيولوجية الكهربائية، مثل استجابات فرط الاستقطاب، من خلال التسجيلات البصرية.
- تعزز هذه التقنية فهمنا لديناميكيات الدوائر العصبية تحت ظروف مختلفة.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الطريقة تقدماً كبيراً في دراسة الدوائر الدماغية والظواهر النفسية العصبية.
- فهي تمكّن الباحثين من مراقبة التغيرات في الإشارات العصبية في الوقت الفعلي.
- وقد يوفر فهم هذه الآليات رؤى حول اللدونة والتطبيقات العلاجية المحتملة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التصوير واسع المجال باستخدام صبغة حساسة للجهد أحادية الفوتون تقييماً وظيفياً مستقراً وطويل الأمد للدوائر العصبية في شرائح الدماغ، مما يعالج تحدياً رئيسياً في التحقق من أهداف العلوم العصبية. وتدعم هذه الطريقة الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال توفير قراءات بصرية كمية عالية الدقة للنشاط العصبي على مدى فترات ممتدة، وهو أمر بالغ الأهمية لتقييم تأثيرات المركبات على ديناميكيات الدوائر في مرحلة الاكتشاف قبل السريري.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استجواب الفرضيات العلاجية من خلال تصور ديناميكيات الإشارات العصبية في الوقت الفعلي ضمن دوائر الحصين.
- القيمة التشغيلية: يوفر تسجيلات مستقرة وقابلة للتكرار لأكثر من 12 ساعة، مما يدعم التقييم الطولي لمدى الارتباط بالهدف وتعديل المسارات.
- القيمة التنبؤية: يسهل الكشف عن التغيرات في الدوائر الناتجة عن التطبيقات الكيميائية، مما يساعد في التعرف المبكر على تأثيرات المركبات ذات النشاط العصبي.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: يحقق معدل إطارات يبلغ 10 kHz ودقة بكسل تبلغ 100x100، مما يتيح إجراء تحليل زمني ومكاني عالي الإنتاجية للاستجابات العصبية.
- جودة الإشارة: يعمل الترشيح ما بعد التسجيل على تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، مما يسمح بالكشف الموثوق عن تغيرات الدائرة تحت العتبة والضرورية لحساسية المقايسة.
- قابلية التكرار: تساهم بروتوكولات مناولة الشرائح وتلوينها المستقرة في تقليل الشوائب الميكانيكية، مما يضمن اتساق البيانات عبر المكررات والجلسات التجريبية.
الأبحاث الانتقالية والسريرية الأولية
- الأهمية المرضية: يدعم تقييم التغيرات في الدوائر العصبية داخل شبكات الحصين، وهي منطقة مرتبطة بالاضطرابات المعرفية والنفسية العصبية.
- الاستمرارية الترجمية: يتيح إجراء تسجيلات بصرية وكهربية فسيولوجية متوازية، مما يعزز التحقق من النتائج الوظيفية عبر أنماط القياس المختلفة.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تساهم ملفات الاستجابة المتباينة بين شرائح الفئران والجرذان في توجيه الترجمة بين الأنواع والمساعدة في تقليل المخاطر عند اختيار المرشحين في المرحلة قبل السريرية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندمج هذه الطريقة في سير عمل الاكتشاف المبكر من خلال توفير قراءات وظيفية للدوائر العصبية تعمل كجسر يربط بين التحقق من الهدف وتحديد المركبات الرائدة، لا سيما بالنسبة للمركبات ذات النشاط العصبي التي تتطلب تقييماً مظهرياً على مستوى الدائرة العصبية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار فرضيات الديناميكيات النفسية العصبية وتوضيح المسارات من خلال التصوير المباشر للإشارات الضوئية المستثارة في دوائر عصبية محددة.
- الفحص: توفر مخرجات ضوئية كمية عالية الدقة مناسبة للتحليل الآلي ومقارنة التغيرات في النشاط العصبي الناتجة عن المركبات.
- التحليلات: تتيح تطبيق مرشحات زمانية مكانية لاستخلاص الإشارة من الضجيج، مما يسهل التكميم الموضوعي لاستجابات الدوائر وتقييم التباين.
- الأبحاث الانتقالية: تربط ملاحظات الدوائر في مرحلة الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال السماح بتسجيلات متكررة على فترات ممتدة لتقييم استقرار وتكرارية تأثيرات المركبات.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يدعم التوحيد القياسي لتحضير الشرائح ومنصة التصوير إعادة الاستخدام عبر مشاريع وسلاسل مركبات متعددة، مما يقلل من التباين المنهجي في عمليات فحص العلوم العصبية المتسلسلة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر رؤية ميكانيكية حول وظيفة الدوائر العصبية، مما يقلل من الغموض في التحقق من الأهداف ويدعم الثقة التنبؤية في الفرز الدوائي العصبي.
- القيمة التشغيلية: تحافظ على الظروف الفسيولوجية وتمنع تحرك الشريحة، مما يضمن الحصول على بيانات مستقرة وخالية من الشوائب لضمان موثوقية فحص المركبات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين الكشف المبكر عن التأثيرات الدائرية الضارة أو غير المستهدفة، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة من تطوير أدوية الجهاز العصبي المركزي (CNS).
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد أولويات المركبات بناءً على ملفات الدوائر الوظيفية المعدلة حسب المخاطر، مما يعزز كفاءة رأس المال في مسارات التطوير قبل السريرية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الفيزيولوجيا الكهربائية، والتصوير البصري، والتعامل مع الأنسجة لضمان حيوية الشرائح وكفاءة التصبيغ.
- يعتمد على أنظمة كاميرات عالية السرعة، ومصادر ضوء فلورية، وتجهيزات تروية قادرة على الحفاظ على الظروف الفيزيولوجية لفترات تسجيل ممتدة.
- يستلزم توحيد معايير توجيه الشرائح، ومدة التصبيغ، وبروتوكولات الاستشفاء بين الفرق لتقليل التباين في خط الأساس للإشارة البصرية ومدى الاستجابة.
- قد يتطلب التكيف مع مناطق أخرى من الدماغ أو نماذج أمراض أخرى التحقق من كفاءة التصبيغ وتعبير الإشارة الخاص بالدائرة العصبية.
- تشمل القيود العملية الحاجة إلى تحسين دقيق لشدة ضوء الاستثارة لمنع السمية الضوئية مع الحفاظ على سعة إشارة كافية للكشف.
