الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

يصف هذا البروتوكول توليد الـ spheroids المشتقة من المريض، والتحليل في المراحل النهائية بما في ذلك القياس الكمي للانتشار، واختبار السمية الخلوية، وقياس التدفق الخلوي، وتلطيخ الفلورة المناعية والتصوير البؤري، من أجل تقييم الدواء إمكانات المرشحين كعلاجات مضادة للأورام. يدعم هذا البروتوكول الطب الدقيق مع تحديد أدوية محددة لكل مريض ومرحلة المرض.

بروتوكول لدينا يوفر طريقة بسيطة لثقافة الخلية 3D و هو قابل جدا لتحليل المصب. وهذا يسهل تقييم عينات المريض غير المتجانسة واستجاباتها المحددة للأدوية. وميزة هذه التقنية هي أنه يمكن تشكيل الـ spheroids من أعداد الخلايا الصغيرة ، مما يسمح بالحفاظ على العينات الأولية النادرة ، وفحص الإنتاجية العالية لاستجابات الأدوية الخاصة بالمريض.

نموذج إسقاط شنقا يخلق بيئة فسيولوجية مع انتشار المخدرات 3D ويفعل الاستجابات المقابلة لمرحلة الورم. وهذا يسمح لتطوير العلاجات المستهدفة والعلاجات الخاصة بالمريض. هذه الطريقة مثالية لدراسة سرطان المبيض, عدم تجانس وتطوير المقاومة الكيميائية.

ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة أنواع أخرى من السرطانات وفئات الخلايا المقاومة للأدوية. عندما الطلاء spheroids، من المهم أن وحدات التخزين الدقيقة ماص. وهذا يضمن التناسق بين الـ spheroids.

وsoidoids والقطرات الخاصة بها هي هشة بطبيعتها وفقدت بسهولة دون التعامل مع السليم، وبالتالي فإننا سوف تظهر كيفية لوحة بشكل مناسب، والحفاظ على وتحليل لوحة قطرة معلقة. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون مايكل بريغنزر، وهو طالب دراسات عليا من مختبرنا. تبدأ بملء كل بئر من لوحة ستة بئر مع أربعة إلى خمسة ملليلتر من الماء الأيونية الأوتوكلاف وسانديش لوحة قطرة معلقة بين الغطاء والجزء السفلي من لوحة.

أضف 800 إلى 1000 ميكرولترات من الماء حول حافة لوحة قطرة معلقة لتوفير بيئة رطبة وتقليل التبخر. بعد ذلك، جمع الخلايا نمت 2D عن طريق فصل لهم مع التربسين، ومن ثم إضافة ستة أو ثمانية ملليلتر من المتوسط التي تحتوي على FBS. استلهم الخلايا مع ماصات المصلية 10 ملليلتر، و إيداعها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.

استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا. إعداد تعليق الخلية وفقا لاتجاهات المخطوطات، وخلط بلطف مع ماصة لضمان توزيع متجانسة. وضع غيض من الماصات في البئر في زاوية من 45 درجة والماصة 20 ميكرولترات من التعليق في كل قطرة معلقة جيدا.

ضع غطاء لوحة الستة جيدا مرة أخرى على واستخدام شريط بالحرارة تمتد لختم حواف. احتضان في حاضنة ترطيب ثاني أكسيد الكربون القياسية وتغذية قطرات شنقا كل يومين إلى ثلاثة أيام عن طريق إضافة اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من خلية ثقافة المتوسطة لكل بيرود التي تحتوي على جيدا. لتحديد مدى انتشار الخلايا وقابليتها للاستمرار، أضف اثنين من ميكرولترات من محلول ريسازورين الذي تم تصفيته إلى الآبار المخصصة لتحليل الانتشار والاحتضان وفقًا لتوجيهات المخطوطات.

بعد فترة الحضانة، وفتح شطيرة قطرة معلقة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وتقديم لوحة 384 جيدا مع غطاء لا يزال في مكانه لقارئ لوحة. وضعه في قارئ لوحة وقراءة لوحة. حفظ التجربة في النافذة المنبثقة وتصدير البيانات إلى جدول بيانات.

إعادة لوحة العودة إلى قاعدة ستة بئر ووضعها في الحاضنة. مرة واحدة وقد تم قراءة جميع النقاط الزمنية لهذا اليوم، إعادة ال عموم لوحة قبل احتضان. لإعداد اللولبيات لتحليل قياس تدفق، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لجمعها من كل بئر وإيداعها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للانقسام.

Aliquot تعليق الخلية في خمس أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة بحيث كل أنبوب يحتوي على ما لا يقل عن 50،000 الخلايا. الطرد المركزي الأنابيب في 400 مرة G لمدة خمس دقائق في الطرد المجهري، ثم الpirate supernatant وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولترات من العازلة Aldefluor. تسمية الأنابيب وفقا لتوجيهات المخطوطات.

إضافة 0.5 ميكرولترات من APC isotype الأجسام المضادة إلى أنبوب ISO APC وميكر واحد من الأجسام المضادة CD133 إلى أنبوب CD133 ALDH. ثم إضافة خمسة ميكرولترات من كاشف DEAB و 0.5 ميكرولترات من ALDH إلى أنبوب DEAB وميكر واحد من ALDH إلى أنبوب CD133 ALDH. دوامة جميع الأنابيب لبضع ثوان واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.

بعد الحضانة، دوامة جميع الأنابيب مرة أخرى والطرد المركزي لهم في 400 مرة G لمدة خمس دقائق. تسمية أنابيب FACS وفقا لاتجاهات المخطوطات وملء حاوية رغوة معزولة مع الجليد. استلهم البيرونت من أنابيب الطرد الدقيق.

ثم إعادة تعليق السيطرة غير الملطخة في 400 ميكرولترات من العازلة FACS وبقية الخلايا في 400 ميكرولترات من المخزن الاحتياطي FACS DAPI. ضع الأنابيب على الجليد حتى يمكن تحليلها على مقياس تدفق. استخدام FlowJo لتحليل البيانات من تدفق مقياس المقاييس.

انقر نقراً مزدوجاً فوق الملف غير المُطَوَّر وتعيين المحور ص إلى جانب ارتفاع مبعثر أو SSCH و المحور س إلى الأمام ارتفاع مبعثر أو FSCH. انقر فوق الزر T بجوار كل محور لضبط المقياس وتعظيم الفصل بين مجموعات الخلايا المختلفة. بعد ذلك ، انقر على زر مضلع الغات ، ورسم بوابة المضلع حول عدد الخلايا وتسمية الخلايا السكانية.

انقر نقراً مزدوجاً فوق المحتوى الخلية في مساحة العمل ثم قم بتغيير محور FSC إلى عرض FSC و محور SSC إلى ارتفاع FSC. اختر بوابة المستطيل لرسم مستطيل فقط حول مجموعة الخلايا الكثيفة في أقصى اليسار، والتي تمتد على محور Y بأكمله. تسمية هذه البوابة خلايا واحدة.

ثم انقر بزر الماوس الأيمن ثم نسخ هذه الخلايا في بوابة الخلايا المفردة المتداخلة ولصقها تحت كل عينة في مساحة العمل. انقر نقراً مزدوجاً فوق بوابة "خلايا مفردة" متداخلة ضمن نموذج DAPI لعرض مجموعة الخلايا المفردة من أنبوب العينة هذا. تغيير قناة محور FSC إلى قناة منطقة DAPI وتغيير قناة محور SSC إلى مدرج التكراري.

انقر فوق الزر T بجانب محور DAPI وانقر على تخصيص محور لضبط مقياس وتكبير الفصل بين موجب DAPI وDAPI السالبة القمم. انقر على تطبيق في النافذة المنبثقة واختر زر بوابة المدى. نشرها على قمة DAPI السلبية وتسمية هذه البوابة الخلايا الحية.

انسخ بوابة الخلايا الحية ولصقها تحت بوابة الخلايا المفردة، تحت أنابيب APC ISO DEAB و ALDH CD133، لتحديد نفس الجزء من الخلايا الحية في كل أنبوب. ثم انقر نقراً مزدوجاً فوق السكان "خلايا حية" متداخلة ضمن ملف نموذج ISO APC، ثم قم بالتبديل إلى منطقة ALDH المحور Y إلى منطقة APC المحور X. تطبيق بوابة رباعية وضبط تقاطع البوابة مثل أن ما يقرب من 0.5٪ من السكان تقع في الجزء العلوي الأيسر من نافذة المؤامرة.

ثم قم بتسمية الأرباع على النحو المطلوب، ثم نسخ ولصق البوابات الرباعية على مجموعات الخلايا الحية المتداخلة تحت ملف DEAB وضبط الخط الرأسي بحيث يقع حوالي 0.15٪ من مجموعة الخلايا داخل الربع الإيجابي ALDH. وأخيرا، نسخ ولصق البوابات الرباعية إلى ملفات CD133 ALDH خلايا حية السكان وتقييم نسب الخلايا الجذعية السرطانية على أساس ALDH وD133 النسب. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل الإنتاجية العالية للخلايا الجذعية السرطانية المشتقة من المريض.

أقل من 10 خلايا في البئر يمكن أن تشكل spheroids موثوق بها وكما تتكاثر الخلايا، وتوسيع spheroids في الحجم. ويمكن قياس القدرة على الانتشار بسهولة مع مقايسة الفلوريسين القائم على resazurin. يمكن تصور تأثير الأدوية على مورفولوجيا الزفيرويد مع تصوير التباين في المرحلة وتحديد كمي من خلال مقارنة ريسازون في الخلايا غير المعالجة والمعالجة.

يمكن التحقق من صحة موت الخلايا عن طريق إضافة Calcein-AM و ethidium homodimer I إلى spheroids ، يليه التصوير على مجهر confocal. وأخيرا، يمكن حصاد السفويدات وتشتيتها في تعليق خلايا واحدة للتحليل مع تدفق الخلايا، مما يجعل من الممكن تمييز فعالية العلاجات المخدرات المختلفة على مجموعات محددة من الخلايا. لتجنب فقدان قطرات، تبخر متوسطة والاختلاف في حجم spheroid، من المهم التعامل مع لوحات بعناية، ماصة بدقة وختم تماما لوحات قطرة معلقة الخاص بك.

لتقييم التغيرات في التعبير الجيني والإشارات القابلة للذوبان بسبب العلاج من المخدرات، يمكن استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ومقيات المناعة المرتبطة بالإنزيمات لتسهيل تطوير العلاجات. هذه التقنية تسمح البحوث في علم الأورام والطب الدقيق وتطوير المخدرات لاستكشاف داخل وبين المريض غير متجانسة وكذلك المقاومة الكيميائية من خلال فحص عالية الإنتاجية المخدرات من الخزعات الصغيرة. عند تنفيذ هذا البروتوكول، تأكد من ارتداء جميع معدات الحماية الشخصية القياسية.

بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة ومعاطف المختبر والسراويل والأحذية القريبة.