الفلورة الكمية في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF) من منتجات جينية محددة في الخلايا المصابة KSHV

البروتوكول مفيد للحصول على نظرة كمية في التنظيم الزمني للمنتجات الجينية الفيروسية ، في سياق الخلايا المضيفة ، وخاصة فيما يتعلق بفيروسات الهربس. يمكن أن تساعد هذه التقنية في معالجة أسئلة البحث المتعلقة بكل من الرنا والفيروسات والبروتينات. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية متوافق مع الميكاويات الحيوية المتزامنة.

للتمسك الخلايا إلى ثمانية شرائح غرفة، وتطبيق 200 ميكرولترات من تعليق الخلية المتأصلة لكل غرفة من شريحة معقمة، ثمانية غرف والسماح بنمو البذور لمدة 12-24 ساعة، في 37 درجة مئوية، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة، pirate الخلايا السوبر وغير مرتبط، وعلى الفور إصلاح الخلايا مع ما قبل المبردة 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني على الجليد، لمدة 30 دقيقة. في نهاية التثبيت، وغسل الخلايا مع ثلاثة، خمس دقائق يغسل في 200 ميكرولترات من 4 درجة مئوية PBS لكل غسل.

بعد الغسيل الأخير، permeabilize الخلايا الثابتة مع 200 ميكرولترات من قبل المبردة 0.5٪ تريتون X في برنامج تلفزيوني في البئر، لمدة 10 دقائق على الجليد. في نهاية permeabilization، وإزالة بعناية الغرف دون تكسير الشريحة، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني مبردة مسبقا. كتلة الخلايا المشطفة مع ما قبل مبردة 4٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية بوليكلان المناسبة من الفائدة في 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة، في أربع درجات مئوية.

في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني جديد واحتضان الخلايا مع جسم مضاد الثانوية المناسبة المقترنة مع الفلوروفوري متوافق مع الجسم المضاد الكشف FISH لمدة ساعة واحدة، في أربع درجات مئوية. بعد ثلاثة PBS يغسل كما هو موضح، إصلاح العينات مرة أخرى في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 10-15 دقيقة قبل permeablization الثانية كما هو موضح. ثم تغطية الشريحة مع رقائق الألومنيوم للحفاظ على إشارة الفلورسنت ومنع photobleaching.

وغسل الخلايا مع 2x سيلت الصوديوم المالحة، قبل تطبيق 45 ميكرولترات من محلول التهجين. بعد ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة، إضافة الماء المقطر إلى oligonucleotides المضادة للانخصاج من الفائدة لتحقيق حجم denaturation إلى 10 ميكرولترات. اضمر oligonucleotides في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، قبل إضافة 35 ميكرولترات من حل التهجين الطازجة في الشريحة الواحدة.

ثم احتضان العينات من 10-24 ساعة في غرفة مرطبة في 37 درجة مئوية، محمية مع احباط. في اليوم التالي، اغسل الزنزانات بـ 2 أو 10 دقائق. 2X سترات الصوديوم المالحة يغسل في درجة حرارة الغرفة، تليها غسل واحد في 1X سترات الصوديوم المالحة لمدة 10 دقائق، في 25 درجة مئوية.

بعد الغسيل الأخير، قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني، لمدة 10-15 دقيقة على الجليد، تليها ثلاثة يغسل مع PBS الطازجة. المقبل، permeabilize العينات كما هو موضح، تليها الحضانة مع FTC المضادة للديووجينين و0.1٪ BSA قبل المبردة في برنامج تلفزيوني، لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح ثلاث مرات في مقسم جديدة، وإصلاح العينات مع ما قبل مبردة 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني، لمدة 10-15 دقيقة في أربع درجات مئوية.

بعد ثلاثة يغسل في برنامج تلفزيوني، وتسمية النوى مع 0.4 ميكروغرام لكل ملليلتر من DAPI و0.5٪ المبردة قبل تريتون X في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة على الجليد، تليها ثلاثة يغسل النهائي في برنامج تلفزيوني. جبل الشرائح مع الخرز الفلورسنت، كما ذات الصلة تجريبيا وفي المتوسطة المناسبة تصاعد. بعد إزالة زيادة المتوسطة تصاعد مع مناديل معقمة، وختم واحد coverslip لكل شريحة مع معاطف متعددة من طلاء الأظافر واضحة، واستخدام المجهر الفلورسنت لتأكيد التنفيذ الناجح للتجربة.

ويمكن بعد ذلك التقاط الصور على مجهر confocal لجمع الصور من العينات في غضون ساعة إلى أسبوع من تصاعد، في 630 مرة التكبير. هذه الأسماك التمثيلية ونتائج الفلوروسينت شبه بيانية وتقدم نظرة ثاقبة في توطين أوليغونوكليوتيد ، بدلاً من المقارنة بين كثافة البقع الفلورية المختلفة ، لأن هذه التجارب لم تتضمن حبة فلورية في إعداد الشريحة. في هذه التجارب، كانت المناطق السيتوبلازمية والنووية ونسبها مختلفة للخلايا المصابة KSHV الكامنة واللائية.

وكما هو موضح في هذا الشكل، يتم التحكم في المنطقة في نسبة النوبات. عندما يتم تثبيط تكرار الحمض النووي KSHV في المرحلة اللبية ، يتحول البروتين الزلي المبكر من نسخة KSHV oligonucleotide إلى تعريب cytoplasmic في الغالب. KSHV الحمض النووي الريبي polyadenylated، ومع ذلك، تعريب إلى مواقع نووية محددة على الرغم من تثبيط تكرار الحمض النووي الفيروسي.

عند إزالة الغرف من الشرائح، والحرص على أن هناك بقايا لاصقة قليلة جدا على الأداة، واستخدام الإيثانول لblmeablize الخلايا وإضعاف لاصقة. يمكن إجراء الميكيميات الحيوية مثل QPCR، واللطخة الغربية، وتسلسل الإنتاجية العالية، جنبا إلى جنب لزيادة البيانات الكمية التي تم جمعها من micrographs.