فصل البشرة الجرذ والأدمة مع Thermolysin للكشف عن موقع محدد الحمض النووي الريبي الالتهابي والبروتين
سبتمبر 29, 2021
هنا هو بروتوكول لفصل البشرة من الأدمة لتقييم إنتاج الوسيط الالتهابي. بعد الالتهاب ، يتم فصل البشرة مخلب الجرذ الخلفي من الأدمة عن طريق الدلس الحراري عند 4 درجة مئوية. ثم يتم استخدام البشرة لتحليل الحمض النووي الريبي عن طريق RT-PCR وتقييم البروتين عن طريق وصمة عار الغربية والكيمياء المناعية.
بروتوكولنا هو تقنية فصل البشرة الجلدية سهلة الاستخدام وغير مكلفة لتحديد إنتاج الوسطاء الالتهابيين والأعصاب الخاصة بالموقع أثناء التهاب الجلد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن يتم فصل الأنزيمية من البشرة من الأدمة في أربع درجات مئوية، والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي والبروتين. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على أنواع الوسطاء التي تعمل على توعية المحطات الأولية أثناء الالتهاب الحاد والمزمن لتطوير تدخلات علاجية جديدة.
يمكن أن يستفيد التئام الجروح والأمراض الجلدية والجروح المزمنة والحروق من هذا البحث. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على الأسطح الظهارية الأخرى، مثل الجهاز الهضمي والقرنيا. قد يختلف وقت الفصل الأمثل قليلا بين المختبرات.
يوصى بإجراء تجربة أولية تقارن النقاط الزمنية المختلفة مع تقييم مورفولوجيا 2D لتحديد جودة الفصل. بعد تأكيد عدم وجود استجابة لرد الفعل دواسة في تخدير ثمانية إلى تسعة أسابيع من العمر سبراغ داولي الفئران، حقن تحت الجلد مخلب هند glabrous الحق مع 100 ميكرولتر من 1X لامبدا كاراجينان المخفف في برنامج تلفزيوني. استخدام الفرجار لقياس سمك مشط القدم مخلب الخلفي مباشرة قبل وفي 6 و 12 ساعة بعد الحقن لتحديد حجم وذمة استجابة للتحفيز.
عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، استخدم مشرط حاد لحصاد قطعة واحدة من ملليمترين من جلد مخلب هند glabrous من مخلب حقن واستخدام ملقط التشحم الدقيق لنقل الجلد إلى ملليلتر واحد من DMEM الباردة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد لمدة 15 إلى 60 دقيقة. في حين أن الأنسجة تحتضن، إضافة ملليلتر واحد من الديناميل الحراري المنشط الطازج إلى 10 آبار من لوحة ثقافة الخلية 24 جيدا على الجليد. في نهاية الحضانة ، استخدم ملقط التشتت الدقيق لنقل عينة جلد واحدة إلى كل بئر من الهليسين الحراري المنشط ، جانب الطبقة القرنية دون غمر العينات في المحلول.
من المهم أن الجلد ليس مغمورة في الزحافية الحرارية، وأن الطبقة القرنية يواجه ما يصل إلى تحقيق فصل فعال. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات، استخدم ملقط التشظي الدقيق لغمر عينة جلد واحدة في سبع إلى ثماني ملليلترات من أربع درجات مئوية DMEM في طبق بيتري للسماح بمساحة أكبر للبشرة للانفصال عن الأدمة. استخدم ملقط لتنظيف البشرة برفق حول محيط الجلد حتى يتم ملاحظة البشرة شبه الشفافة على حدود العينة.
عندما ينفصل البشرة بشكل ملحوظ عن الأدمة ، فهم بعناية كل طبقة من الجلد مع زوج واحد من ملقط وسحب البشرة ببطء من الأدمة ، ثم تقييم مدى حساسية البشرة المعزولة عن طريق المجهر الخفيف للتأكد من أنها متسقة بصريا. إذا تم فصل الطبقات بشكل صحيح، ضع الأنسجة الجلدية والجلدية في حاويات فردية من خمس ملليمولار EDTA في DMEM في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد تعطيل الهرموسين، قم بإصلاح جزء من البشرة في مثبت مناسب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الهياج.
في نهاية الحضانة ، ضع الأنسجة الثابتة في 10٪ سكروز في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض ، قبل تجميد العينة في مصفوفة مناسبة لتضمين الأنسجة للقسم. استخدام cryostat للحصول على 14 ميكرومتر سميكة المقاطع العرضية وذوبان جبل المقاطع على شرائح المجهر الزجاجي المغلفة الجيلاتين. بعد التجفيف على شريحة أكثر دفئا، وصمة عار العينات مع حل العمل من الأزرق toluidine لمدة 90 ثانية.
بعد ذلك ، اغسل اللون الأزرق التولويدين برفق من الشرائح مع PBS وعارض الأغطية مع وسيط تصاعد مائي ، ثم لاحظ البشرة مع المجهر برايتفيلد في تكبير 50 إلى 250X. يسبب حقن كاراجينان في مخلب الفئران الخلفي أعراضا كلاسيكية للالتهاب ، مثل الاحمرار والوذمة في كل من 6 و 12 ساعة بعد الحقن. يمكن استخدام المجهر برايتفيلد لتقييم فعالية فصل الزحم الحراري للبشرة والأدمة من جلد مخلب الجرذ الجليدي الخلفي.
في الواقع ، يظهر تلطيخ الأزرق التولويدين من المقاطع العرضية البشرة أن البشرة منفصلة عن الأدمة عند الغشاء الأساسي ، ولكن تظل حواف Rete البشرة والمسافات البادئة من الحليمة الجلدية سليمة. علاوة على ذلك ، يتم ملاحظة جميع طبقات خلايا الكيراتينية. النشاف الغربي من البشرة المنفصلة بالحرارة ينتج نتائج متسقة ، مما يشير إلى مستويات بروتين مستقرة خلال هذه التقنية عند أربع درجات مئوية.
يتم الكشف عن القليل جدا من البروتين NGF في البشرة الفئران السذاجة، ولكن يتم رفع مستويات البروتين NGF بشكل كبير بعد ست ساعات من الالتهاب الناجم عن الكاراجينان. بعد 12 ساعة من الحقن ، يتم تقليل مستويات NGF مقارنة بتلك التي لوحظت في ست ساعات ، ولكنها تظل مرتفعة بالنسبة للضوابط. كما هو متوقع من تحليل البقع الغربية ، لا يتم الكشف عن النشاط المناعي NGF في عينات أنسجة البشرة للتحكم السذاجة ، ولكن في ست ساعات بعد الالتهاب الناجم عن الكاراجينان ، لوحظ النشاط المناعي ل NGF في معظم خلايا القرنية في غرانوبولوسوم الطبقة والطبقة لوسيدوم.
وهناك عدد قليل من الخلايا في سبينوسوم الطبقة هي أيضا NGF المناعي. عند استخدام thermolysin لعزل البشرة سليمة، من المهم أن نتذكر أن وقت الفصل الأمثل يجب أن تحدد تجريبيا من قبل المستخدم النهائي. يمكن استخدام تقنيات بروتيومية جزيئية مختلفة للتحقق من صحة التعبير عن بروتينات محددة و / أو نصوص الجينات الأولية للتأكد من أن هذا الإجراء لا يغير التعبير القاعدي.
ستسمح هذه التقنية للفصل الجلدي الجلدي للباحثين بالإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالتعبير الخاص بالموقع عن الأعصاب والوسطاء الالتهابيين في نماذج التهابية جلدية مختلفة. حمض بيريك وبارافورمالديهايد خطرة. العمل مع كل من المواد الكيميائية في غطاء الدخان، واستخدام الملابس الواقية الشخصية والقفازات وغسل وجهك واليدين بعد التعامل معها.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة فعالة لفصل البشرة عن الأدمة لتقييم إنتاج الوسطاء الالتهابيين. تستخدم التقنية الترموليسين عند 4 ℃ للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي المرسال والبروتين لتحليلات لاحقة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الالتهاب
- طب الجلدية
الخلفية
- فهم الوسطاء الالتهابيين أمر بالغ الأهمية لتطوير التدخلات العلاجية.
- تؤثر التهابات الجلد على حالات مختلفة، بما في ذلك الجروح المزمنة والحروق.
- من الضروري الحفاظ على سلامة العينات البيولوجية لإجراء تحليل دقيق.
- يمكن تعديل هذه الطريقة لاستخدامها في أنسجة طلائية أخرى.
هدف الدراسة
- لتقييم إنتاج الوسطاء الالتهابيين في مواقع محددة أثناء التهاب الجلد.
- لتوفير رؤى حول إنتاج النيوروتروفين استجابةً للالتهاب.
- لتسهيل البحث الذي قد يؤدي إلى استراتيجيات علاجية جديدة.
الطرق المستخدمة
- الفصل الأنزيمي للبشرة عن الأدمة باستخدام الترموليسين.
- يتم الفصل عند 4 ℃ للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي المرسال والبروتين.
- تحليل الحمض النووي الريبي المرسال عبر RT-PCR.
- تقييم البروتينات من خلال Western blot والكيمياء المناعية.
النتائج الرئيسية
- فصل ناجح للبشرة والأدمة مع الحفاظ على سلامة العينة.
- تحديد الوسطاء الالتهابيين التي تحسس النهايات الحسية الأولية.
- تطبيقات محتملة في أبحاث التئام الجروح وأمراض الجلد.
- طريقة قابلة للتكيف لأسطح طلائية أخرى، مثل الجهاز الهضمي.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة الاستجابات الالتهابية في الجلد.
- قد تقدم الرؤى المكتسبة معلومات حول النهج العلاجية للحالات المتعلقة بالجلد.
- قد تستكشف الأبحاث المستقبلية الاختلافات في أوقات الفصل المثالية عبر المختبرات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Site-specific separation of rat epidermis and dermis using cold thermolysin enables precise quantification of inflammatory mRNA and protein in distinct skin layers. This workflow supports mechanistic de-risking and target validation for inflammatory mediators and neurotrophins relevant to dermatological and wound-healing research. The protocol's preservation of molecular integrity at low temperatures enhances predictive confidence for downstream translational studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of site-specific inflammatory mediator and neurotrophin expression in skin injury models.
- Supports biological de-risking by maintaining mRNA and protein integrity during tissue separation.
- Facilitates functional target validation for mediators implicated in acute and chronic inflammation.
- Improves predictive confidence for advancing skin inflammation targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact epidermal and dermal samples for quantitative molecular assays.
- Enables reproducible RT-PCR, western blot, and immunohistochemistry analyses of separated layers.
- Supports assay standardization by preserving tissue architecture and molecular content.
- Provides reliable biological material for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for skin inflammation, wound healing, and sensitization.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of inflammatory biomarkers.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust molecular readouts.
- Facilitates adaptation to other epithelial tissues, broadening translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling precise molecular analysis of skin layers following inflammatory challenge.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for mediator localization and pathway involvement in skin inflammation.
- Screening: Provides standardized, reproducible samples for quantitative molecular assays.
- Analytics: Delivers robust mRNA and protein measurements for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects site-specific molecular changes to disease-relevant endpoints in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to various epithelial tissues and inflammatory models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in skin inflammation research.
- Operational Value: Standardizes tissue separation and molecular analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program applicability in dermatology and inflammation portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, enzymatic digestion, and molecular analysis.
- Needs access to cold incubation, microdissection tools, and analytical platforms for RT-PCR and western blotting.
- Demands cross-team standardization of separation times and quality control via morphology evaluation.
- Adaptable to other epithelial tissues with empirical optimization of separation parameters.
- Optimal separation time and tissue handling must be empirically determined for each lab setting.
