حقن Gryllus بيماكولاتوس البيض
August 22nd, 2019
هنا نقدم بروتوكول لحقن بيض الكريكيت، وهي تقنية التي تعمل كطريقة تأسيسية في العديد من التجارب في الكريكيت، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، تدخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجينومي.
هذه التقنية بمثابة طريقة تأسيسية للتجارب المصممة لم مقايسة الجنينية أو اليرقات التنمية من لعبة الكريكيت. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مرنة وستدعم عدة أنواع من النهج التجريبية، مثل تلك التي تستخدم تدخل الحمض النووي الريبي أو التلاعب الجينومي. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون هادلي ويلسون هورش، الباحث الرئيسي في المختبر.
لبدء هذا الإجراء الرطب الطائرة طاحونة الغزل من المطوق مع المياه نازف. ضع الإبرة المسحوبة في الممشوق وحولها إلى زاوية 20 درجة. خفض الإبرة حتى مجرد لمس لوحة طحن وت شطبها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
تقييم شطبة عن طريق وضع إبرة مشطوف على الشريط عصا مزدوجة التي تم الالتزام بها شريحة المجهر الزجاجي. ضع الشريحة على خشبة مسرح مجهر مركب مجهز بكاميرا وبرنامج للحصول على الصور. الحصول على صورة من الإبرة باستخدام هدف 20x.
استخدام برنامج التصوير لقياس قطر التجويف الداخلي للإبرة فقط قريبة لفتح مشطوف. تخلص من أي إبر ذات فتحة أصغر من ثمانية ميكرومترات أو أكبر من 12 ميكرومتر. أولاً، اصنع 40 ملليلتر من 1٪ agarose في الماء وسكبه في طبق بيتري طوله 10 سنتيمترات.
وضع ختم البيض جيدا على سطح agarose قبل أن يتجمد. بمجرد أن يتم ترسيخ agarose ، وإزالة الطابع للكشف عن الآبار. المقبل, ملء لوحة بئر agarose مع HBS تحتوي على 1٪ البنسلين ستريبتوميسين.
ضع الغطاء على الطبق، ولفه في بارا فيلم واخزنه عند أربع درجات مئوية. بعد هذا، ملء طبق بيتري 35 ملليمتر مع رمال الملعب الأبيض لجعل طبق جمع البيض للصراصر لوضع البيض في. غطي طبق البيض بمنشفة ورقية مربعة تقطع إلى حوالي 18 في 18 سنتيمترًا.
ملء مع مياه الصنبور من خلال منشفة ورقية. ثم، إمالة طبق بيتري والضغط بلطف على الجزء العلوي لإزالة المياه الزائدة. ثني زوايا ساحة منشفة ورقية تحت الطبق ووضع طبق البيض في غطاء مقلوب مما يساعد على الحفاظ على منشفة ورقية في مكانها.
ضع طبق البيض في سلة الكريكيت واسمح للإناث البالغات ببويض البيض لمدة ساعة إلى ساعتين. وفي الوقت نفسه، تسمح لطبق agarose لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة استعدادا لعقد البيض للحقن. عندما تكون جاهزة، قم بإزالة طبق جمع البيض، الذي يحتوي الآن على بيض مُنْضَن حديثاً، من صندوق الكريكيت.
إزالة منشفة ورقية ووضع مصفاة مع حجم المسام بين 0.5 ومتر واحد ملليمتر فوق منقار. شطف محتويات طبق وضع البيض في المصفاة تحت مياه الصنبور الجارية بلطف. سوف تسقط الحبوب الرملية من خلال شبكة المصفاة في القارس أدناه في حين أن بيض الكريكيت يبقى في سلة المصفاة.
املأ الحاوية بماء التناضح العكسي وضعه في صينية. عكس مصفاة على الحاوية والاستفادة منه ضد الطبق لإزاحة البيض في الماء. البيض سوف يغرق في الجزء السفلي من الحاوية.
بعد ذلك، استخدم المقص لقطع طرف P1000 ماصة لجعل فتحة ما يقرب من ثلاثة ملليمترات في القطر. ضع هذه النصيحة على طرّب P1000، واستخدمه لنقل البيض من الحاوية إلى طبق قوالب البيض agarose. باستخدام ملاقط بلاستيكية، يصطف البيض في آبار أغاروز.
كل بيضة سوف تغرق في الجزء السفلي من بئر الفرد. غطي طبق بيتري بغطاء حتى يصبح جاهزاً للحقن. للبدء، ضع طبق البيض تحت المجهر التشريحي وحدد تكبيرًا منخفضًا يبلغ حوالي 10x.
ارسم 1.5 ميكرولتراتر من محلول الحقن باستخدام 20 نصائح تحميل ميكرولتر وماصة P10 وأدخل طرف التحميل في الطرف الواسع من إبرة الحقن. طرد محلول الحقن في إبرة الحقن. أدخل الإبرة في مسكن الحقن وشدها ، مع التأكد من إدخال الإبرة بشكل صحيح وبحزم في السكن.
ثم أدخل بعناية في مسكن الحقن في ميكرومانبولاتور، مع الحرص على عدم كسر أو التعرض للأذى من قبل الإبرة. أثناء النظر إلى كل من البيض والإبرة من خلال المجهر ، حرّك الإبرة بالقرب من X في الزاوية اليسرى العليا من شبكة الطبق. خفض الإبرة حتى تلميح يدخل HBS بالإضافة إلى البنسلين ستريبتوميسين حل المخزن المؤقت في الطبق.
مركز الإبرة في مجال الرؤية وتحريك طبق البيض بحيث الإبرة هي بضعة ملليمترات أقرب إلى حافة الطبق من البيض. بعد ذلك، تعيين المجهر إلى مرشح مناسبة لرودامين لمراقبة الفلوريس في الإبرة والتركيز على طرف لها. على الحقن المجهري ببطء تحويل مقبض الباب التوازن في اتجاه عقارب الساعة حتى يبدأ حل الحقن لتسرب من الإبرة في حل التعليق.
ثم بدوره مقبض الباب مرة أخرى عكس عقارب الساعة قليلا حتى صبغ فقط يتوقف تسرب من الإبرة. مع الإبرة لا تزال تتمحور في مجال الرؤية، ونقل طبق البيض بحيث يتم توجيه الإبرة في البيضة التي سيتم حقنها أولا. ضبط التكبير إلى حوالي 50x بحيث تملأ بيضة واحدة معظم مجال الرؤية.
استخدام كل من micromanipulator ويد واحدة على طبق البيض لتحريك الإبرة في موقف للحقن. استخدم المايكرومانيبولاتر لتقدم الإبرة وأدخل الطرف في أول بيضة يتم حقنها، مع التأكد من إدخال الإبرة عند 20 إلى 30٪ من طول البيض من الطرف الخلفي لتعامد البيض على المحور الطويل للبيضة. حقن الحل مع إما دواسة القدم حقن أو زر الحقن على الحقن.
تشير bolة صغيرة من المواد الفلورية داخل البيضة إلى الحقن الناجح. بعد ذلك، تراجع الإبرة من البيضة. إذا تم رفع البيضة عن غير قصد من بئرها عند التراجع عن الإبرة ، استخدم ملقطًا صغيرًا لدفع البيضة مرة أخرى إلى البئر أثناء سحب الإبرة.
في هذه الدراسة، يتم حقن بيض الكريكيت باستخدام تقنية تعمل كطريقة تأسيسية في العديد من التجارب، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تدخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجينومي. معدل البقاء على قيد الحياة هو معلمة هامة لتقييم نجاح هذه التجربة. معظم البيض الميت يمكن بسهولة أن تحدد عن طريق البصر كما صفار والأنسجة الجنينية داخل البويضة تبدأ في التكتل بشكل غير متساو، وفي نهاية المطاف معظم صفار سوف تهاجر إلى جانب واحد من البيضة.
عند تقييم بعد أربعة إلى ستة أيام، نجا أكثر من 85٪ من البيض غير المُصنَّع، في حين أن البيض المحقون بالكاشيف التجريبية كان معدل بقائه أقل بشكل عام. مطلوب السيطرة على جميع جوانب الحقن نفسه، بما في ذلك ثقب إبرة، وإدخال الصبغة والعزلة، أو وجود مركبة أو مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA، من أجل فهم الآثار الحقيقية للتلاعب التجريبية حاول. الطريقة التي يقيم المرء نتائج phenotypic من الحقن يعتمد على ما تم حقنه.
على سبيل المثال، قد تكون التغيرات الظاهرية نتيجة لضربات الميرنا المحددة واضحة على مستوى التشريح الإجمالي. من ناحية أخرى إذا تم إدراج cDNA ترميز EGFP الموسومة الجين histone 2B تحت سيطرة المروج أكتين G.bimaculatus في جينوم الكريكيت باستخدام transposase الظهر، يصبح من الممكن تصور كل نواة في البيض باستخدام الفلوريسنس لإثارة EGFP الموسومة hist 2B البروتين. ضبط التوازن بحيث لا تسد الإبر هو خطوة حاسمة في هذا الإجراء.
قد تحتاج إلى إجراء عدة تعديلات بعد الحقن اللاحقة منذ صفار أحيانا تسد طرف إبرة. الكريكيت هو حشرة hemimetabolous التي فروع basally إلى الحشرات الهولوميتabolous درس جيدا مثل Drosophila. إن دراسة تطوير لعبة الكريكيت ستساعدنا على فهم المزيد عن التطور والتطور في جميع أنحاء المملكة الحيوانية.
هذه التقنية تأخذ بعض الممارسة. نوصي بممارسة الحقن التحكم حتى معدل البقاء على قيد الحياة أربعة أو خمسة أيام بعد الحقن هو على الأقل 80٪
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لحقن بيض الجراد، وهي طريقة أساسية للعديد من التجارب في أبحاث الجراد. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للدراسات التي تتضمن التداخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجيني.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- التلاعب الجيني
الخلفية
- يتم استخدام بيض الجراد في مناهج تجريبية مختلفة.
- تدعم التقنية الدراسات على تطور الجنين واليرقات.
- إنها قابلة للتكيف مع تصاميم تجريبية مختلفة.
- التداخل الحمض النووي الريبي هو أحد التطبيقات الرئيسية لهذه الطريقة.
غرض الدراسة
- لعرض بروتوكول لحقن بيض الجراد.
- لتوفير طريقة أساسية للتجارب المستقبلية للجراد.
- لتسليط الضوء على مرونة التقنية للتطبيقات البحثية المختلفة.
الطرق المستخدمة
- بلل مستوى الطاحونة الدوارة للمبرش بالماء.
- ضع الإبرة المجذوبة في المبرش بزاوية 20 درجة.
- أخفض الإبرة لتصل إلى لوحة الطحن وحيدها لمدة 2-3 دقائق.
- عرض تقديمي من Hadley Wilson Horch، الباحث الرئيسي.
النتائج الرئيسية
- التقنية فعالة لحقن بيض الجراد.
- تدعم مناهج تجريبية مختلفة في أبحاث الجراد.
- تظهر مرونة في التطبيق للتداخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجيني.
- توفر طريقة موثوقة لدراسة تطور الجنين واليرقات.
الاستنتاجات
- تعتبر هذه التقنية للحقن أساسية لأبحاث الجراد.
- تقدم تنوعًا لتصاميم تجريبية مختلفة.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذه الطريقة لأبحاث متقدمة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables functional gene manipulation in non-traditional model organisms, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By providing a flexible system for phenotypic screening across diverse species, it enhances predictive confidence in pathway interrogation and reduces reliance on single-model assumptions. The method supports scalable assay development for compound screening and biomarker discovery in evolutionarily relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through gene knockdown, overexpression, or editing in emerging model systems.
- Operational Value: Supports functional validation of targets outside traditional genetic systems, reducing species-specific bias.
- Scientific Value: Facilitates phenotypic screening to assess target essentiality and pathway involvement in embryonic development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for tracking gene expression or cellular dynamics in vivo.
- Operational Value: Enables standardized preparation of insect embryos for high-content screening of pharmacological or genetic perturbations.
- Scientific Value: Supports dose-response and temporal profiling of injected reagents such as dsRNA, mRNA, or CRISPR components.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system to study conserved developmental pathways with translational biomarker alignment.
- Operational Value: Allows cross-species comparison of target function, improving extrapolation to mammalian systems.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by revealing evolutionary conservation or divergence in gene function prior to mammalian investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling target validation and assay development before lead identification and preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports gene function interrogation and pathway clarification in genetically intractable but evolutionarily informative species.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative phenotypic outputs essential for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of survival rates, phenotypic penetrance, and subcellular localization as key analytical readouts.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to conserved pathways, supporting biomarker alignment and risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for injecting diverse reagents across multiple experimental campaigns and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enabling functional genomics in understudied but phylogenetically important organisms.
- Operational Value: Offers a scalable, low-cost system for generating dozens of injectable embryos per experiment with survival rates up to 80% after optimization.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by identifying target liabilities early through cross-species phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions by providing mechanistic insight into target function across evolutionary distances.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, embryology, and microscopy for precise needle handling and embryo manipulation.
- Depends on specialized instrumentation including bevelers, micromanipulators, microinjectors, and fluorescence-capable microscopes.
- Necessitates standardization of egg collection, agarose well preparation, and injection buffer formulation across users and sites.
- Involves adaptation considerations for different insect species, egg sizes, and developmental stages.
- Includes practical limitations such as needle clogging from yolk debris and skill-dependent survival rates requiring training and practice.
