Name: تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: تعلم تقنية الهضم على الغشاء لتحليل تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام طيف الكتلة، حيث تزيد من الإنتاجية عبر إزالة الحاجة إلى الترحيل الكهربائي الهلامي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI منحة رقم 17K09869 (إلى AM)، الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI منحة رقم 15K09418 (إلى TM)، وهي منحة بحثية من مؤسسة كانهارا ايشيرو للعلوم الطبية ومنحة بحثية من مؤسسة سوزوكان التذكارية (جميعها إلى TM).

1- هطول الأمطار المناعية
ملاحظة: استخدمنا كبريتات دودسيل غير الصوديوم (SDS) التحلل العازلة وelution سيترات، كما هو موضح في الأقسام التالية. ومع ذلك، قد يكون استخدام تقنية بديلة في المنزل هطول الأمطار المناعية ينطبق أيضا لإعداد عينات LC-MS/MS.
<ol><li>الخلايا المستزرعة عبر الفيكتمع مع ناقلات ترميز علامة الظهارة وحدها أو بروتين الانصهار. للحصول على البيانات التمثيلية، نقل الخلايا J774 (1 × 106)مع ناقلات ترميز البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) وحدها أو GFP تنصهر Capn6 (كالبين-6 الجينات) باستخدام liposomes الموجبة.</li>
	<li>تترافق الأجسام المضادة إلى الخرز المغناطيسي.<ol>
<li>لهذا الغرض، مزيج المضادة للGFP الأجسام المضادة (2 ميكرولتر / رد فعل) مع الخرز المغناطيسي (25 ميكرولتر / رد فعل) في 500 ميكرولتر من احتياطي الفوسفات سيترات (24.5 مم حامض الستريك، 51.7 مليون متر فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة؛ درجة الحموضة 5.0) في أنبوب اختبار 1.5 مل.</li>
		<li>تدوير الخليط في 50 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم، غسل الخرز IgG-المترافق ثلاث مرات مع حاجز الفوسفات سيترات التي تحتوي على 0.1٪ البولي أوكسي إيثيلين (20) مونولوريت السوربيتان.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyse الخلايا المنقولة باستخدام المخزن المؤقت lysis المناسبة. للحصول على بيانات تمثيلية، تسين الخلايا المنقولة لمدة 30 دقيقة على الجليد في 400 ميكرولتر من المخزن الاحتياطي للليسات (50 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك؛ درجة الحموضة 7.5، 120 مل كلوريد الفينيل، 0.5٪ بولي (أوكسيثيلين) الإيثر الثنائي الفينيل الثماني) التي تحتوي على 40 ميكرومول /L فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد، 50 ميكروغرام / مل ليوبيبين، 50 ميكروغرام / مل ليوبيبين، 50 ميكروغرام / مل أبروتينين، 200 ميكرومول / لتر أورثوفادات الصوديوم، و 1 مم حمض الإيثيلين غليكول رباعي الأسيتيك (EGTA) في أنابيب اختبار 1.5 مل 24 ساعة بعد التغوط.</li>
	<li>مسح lysate عن طريق الطرد المركزي في 15،000 × ز لمدة 5 دقائق وجمع supernatant.</li>
	<li>امسح الليسات. إضافة حبات مغناطيسية غير مسماة (25 درجة مئوية / رد فعل) في أنبوب اختبار 1.5 مل. غسل الخرز ثلاث مرات مع 500 درجة مئوية من المخزن المؤقت الفوسفات سيترات. بعد إزالة حاجز فوسفات سيترات في الغسيل النهائي، إضافة lysate الخلية على الخرز المغناطيسي. تدوير الخليط باستخدام الدوار في 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>وضع أنبوب الاختبار على موقف المغناطيسي لمدة 5 دقائق لفصل المغناطيسي، وجمع lysate الخلية. ينصح باستخدام الحامل المغناطيسي المعين من قبل الشركة المصنعة.</li>
	<li>ربط البروتينات المستهدفة إلى الخرز المترافق. ضع الغلوبولين المناعي (Ig) G-مترافق الخرز على حامل مغناطيسي لمدة 5 دقائق للفصل المغناطيسي، وتجاهل المخزن المؤقت للسترات، ثم أضف الليزات الخلية إلى الخرز المنفصل.</li>
	<li>تدوير الخليط في 50 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>فصل البروتينات المستهدفة من البروتينات غير المستهدفة الحرة. غسل الخرز ثلاث مرات باستخدام 500 درجة مئوية من حاجز الفوسفات سيترات التي تحتوي على 0.1٪ بوليأوكسي إيثيلين (20) مونولوريت السوربيتان. بعد الغسيل النهائي، أضف 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للسيترات (الرقم الهيدروجيني 2-3)، واحتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لelute البروتينات المستهدفة. ملاحظة: إذا كان الانتعاش من الترسيب المناعي غير كافية، فإن استخدام علامات النعت البديلة، مثل FLAG أو HIS، قد يحسن الكفاءة. وإذا كانت كفاءة الإلتذى غير كافية، فإن استخدام الأيلونات الأخرى، مثل الحل القائم على SDS، قد يحسن الكفاءة.</li>
</ol>2. على غشاء الهضم من البروتينات
ملاحظة: استخدام المواد والمعدات الخالية من البروتين ضروري لتجنب التلوث بالبروتينات الخارجية. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن أن المشغل ارتداء قناع الجراحية والقفازات لتجنب التلوث بالبروتينات البشرية.
<ol><li>قطع أغشية PVDF إلى قطع 3 مم × 3 مم باستخدام مقص الجراحية التي تم مسحها مع الميثانول والمجففة مباشرة قبل الاستخدام.</li>
	<li>أضف 2-5 ميكرولتر من الإيثانول على قطع غشاء PVDF على رقائق الألومنيوم النظيفة.</li>
	<li>قبل أن تجف تماما، إضافة eluant (2-5 ميكرولتر لكل منهما، 4-6 قطع لكل عينة) على أغشية PVDF المائية، ومن ثم الهواء الجاف الأغشية حتى يصبح سطح الغشاء غير لامع. يمكن تخزين الأغشية المجففة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.</li>
	<li>نقل جميع الأغشية في أنابيب بلاستيكية 1.5 مل، إضافة 20-30 درجة مئوية من الإيثانول لجعل الأغشية المائية، ومن ثم إزالة الإيثانول باستخدام ماصة.</li>
	<li>قبل أن يجف الغشاء تماما، إضافة 200 درجة مئوية من dithiothreitol (DTT) القائم على حل رد الفعل (80 mM NH4HCO3،10 MM DTT، و 20٪ acetonitrile) واحتضانه في 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.</li>
	<li>استبدال حل رد الفعل مع 300 درجة مئوية من محلول يودواسيتاميد (80 مل NH4هكو3،55 mM يودواسيتاميد، و 20٪ أسيتوتريل)، وحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.</li>
	<li>غسل الأغشية مرتين مع 1 مل من الماء المقطر ومرة واحدة مع 1 مل من 2٪ acetonitrile عن طريق خلط دوامة ل > 10 s.</li>
	<li>حل lyophilized MS-الصف التربسين (جدولالمواد)مباشرة في حل رد الفعل (30 mM NH4HCO3 تحتوي على 70٪ acetonitrile). إضافة 100 درجة مئوية من محلول التفاعل الذي يحتويعلى 1 ميكروغرام من التربسين (جدول المواد) (30 mM NH4HCO3 التي تحتوي على 70٪ acetonitrile) وحضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>نقل حل التفاعل الذي يحتوي على هضم اتّصال في أنبوب اختبار نظيف بـ 1.5 مل باستخدام ماصة.</li>
	<li>إضافة 100 درجة مئوية من محلول الغسيل (70٪ acetonitrile / 1٪ حمض ثلاثي الفلوروسيتيك) إلى الغشاء واحتضانه في 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. إضافة آخر 100 درجة مئوية من محلول الغسيل إلى الغشاء وsonicate لمدة 10 دقيقة. ثم جمع حل غسل ومزيج مع حل رد الفعل.</li>
	<li>تغطية أنبوب الاختبار مع قطعة من فيلم المختبر وجعل اثنين من الثقوب الصغيرة مع إبرة. تجفيف الحل باستخدام المكثف فراغ.</li>
	<li>إذابة بقايا في 10 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.2٪. بعد الطرد المركزي (12،000 × ز، 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة)، نقل supernatant في أنبوب عينة. ملاحظة: الwashes هي الخطوات الهامة لهذا المقطع. خلال هضم البروتين على الغشاء ، فإن غسل الأغشية التي تحتوي على البروتينات المعطلة بعد التخفيض والألكيلية بالماء المقطر ، يليه 2٪ أسيتونتريل ، لأكثر من 10 ثوان لكل منهما ، أمر بالغ الأهمية لإزالة الكواشف.</li>
</ol>3. LC-الكهربائي التأين (ESI) - MS / MS تحليل
<ol><li>تفعيل أداة ESI-MS/MS (جدولالمواد)إلى جانب نظام نانو LC HPLC (جدولالمواد). ربط عمود مسبق(جدولالمواد) وعمود تحليلي (جدولالمواد).</li>
	<li>قبل التحليل، معايرة مطياف الكتلة باستخدام هضمات التربتيك من الزلال المصل البقري المذاب في حمض الفورميك 0.2٪، والذي يوفر الببتيدات القياسية.</li>
	<li>تحليل العينات باستخدام وضع أيون إيجابي ونطاق كتلة من 400-1,250 م / ض؛ ثم الحصول على ما يصل إلى 10 MS / MS الأطياف (100 مللي ثانية لكل منهما) مع نطاق كتلة من 100-1600 م / ض وتدرج خطي من 2٪ -80٪ acetonitrile و 0.2٪ حمض الفورميك لمدة 80 دقيقة بمعدل تدفق 300 مل / دقيقة.</li>
	<li>تحليل بيانات الإخراج باستخدام برنامجلتحديد البروتين (جدول المواد) لتحديد البروتينات المرتبطة بالمرشح. لتحديد إيجابي للبروتين مرشح، مطلوب الكشف عن واحد على الأقل جزء الببتيد عالية الدقة (> 95٪ الإخلاص).</li>
	<li>حذف البروتينات التي عجلت بالمثل في GFP التعبير عن lysates (transfection من ناقلات التعبير عن علامة GFP وحدها) من قائمة البروتينات المرشحة. ملاحظة: إذا تم تحديد عدد قليل من البروتينات في تحليل قاعدة البيانات، فإن تعديل شروط الحصول على MS/MS (على سبيل المثال، تغيير الوقت من 100 مللي ثانية لكل منها إلى 50 مللي ثانية) قد يزيد من عدد البروتينات المحددة.</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

لقد سبق لنا وصف تحليل التعديلات التأكسدية للبروتين اللابولي ب-100 في البروتين الدهني منخفض الكثافة المؤكسد باستخدام LC-MS/MS يسبقه تقنية الهضم على الغشاء6. في هذه الدراسة، جمعنا هذه التقنية مع الترسيب المناعي وحددنا العديد من البروتينات المرتبطة بالكالبين-6. هذه التقنية الجديدة تمثل طريقة مريحة لفحص البروتينات المرتبطة بالمرشح. Calpain-6 هو عضو غير بروتيوليتيك من عائلة كالبين بروتيوليتيك11 التي يقال أنها تعدل الوظائف الخلوية من خلال تفاعلاتالبروتين والبروتين<sup class="xref...

على الرغم من أن البروتينات تلعب أدوارًا تأسيسية في الكائنات الحية، إلا أنها يتم تصنيعها ومعالجتها وتدهورها باستمرار في البيئة داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، تتفاعل البروتينات داخل الخلايا في كثير منالأحيان جسديا وكيميائيا بيولوجيا، مما يؤثر على وظيفة واحد أو كليهما 1،2،3. على سبيل المثال، الربط المباشر للبروتين المتجانس المرتبط بـ spliceosome CWC22 مع عامل بدء الترجمة eukaryotic 4A3 (eIF4A3) ضروري لتجميع مجمع تقاطع الإكسون4. وتماشيا مع ذلك، فإن متحولة eIF4A3 التي تفتقر إلى التقارب لCWC22 يفشل في تسهيل تقاطع exon معقدة يحركها mRNA الربط4. وهكذا، فإن دراسة تفاعلات البروتين أمر بالغ الأهمية لفهم دقيق للتنظيم الفسيولوجي وكذلك للوظائف الخلوية.
وقد تم تطبيق التطورات الأخيرة في قياس الطيف الكتلي (MS) على التحليل الشامل للتفاعلات البروتينالبروتينية. على سبيل المثال، يمكن الترسيب المشترك للبروتينات الذاتية أو البروتينات ذات العلامات الخارجية مع البروتينات المرتبطة بها، تليها تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد، من تحديد تفاعلات البروتين الجديدة5. ومع ذلك، فإن أحد الاختناقات الرئيسية لتحليل التصلب المتعدد/التصلب المتعدد هو ضعف الانتعاش من الملخصات التربتيكية لعينات البروتين. لإجراء التحليلات البروتيومية على lysates الخلية، وتستخدم عموما في هلام وتقنيات الهضم على غشاء لإعداد عينات MS / MS. لقد قارنا سابقا إجراء الهضم في هلام مع تقنية الهضم على الغشاء6، وأظهرت أن هذا الأخير كان مرتبطا مع تغطية تسلسل أفضل. غشاء ثنائي الفينيل (PVDF) قد يكون مناسبا لهذا الغرض لأنه قوي ميكانيكيا ومقاومة لتركيزات عالية من المذيبات العضوية7،8، مما يسمح بالهضم الأنزيمي للتعطيل البروتينات في وجود 80٪ أسيتوتريل9. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي الجمود على الغشاء إلى تغييرات في البروتينات المستهدفة، مما يؤدي إلى تحسينات في كفاءة الهضم التربتيكي10. وفقا لذلك، في هذه المقالة، وصفنا استخدام تحليل المناعة-LC/MS/MS لتفاعلات البروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء. تسهل هذه الطريقة البسيطة التحليل المريح للتفاعلات البروتينية حتى في المختبرات غير المتخصصة.

<table><tbody><tr><td>أسيتونيتريل</td><td>واكو</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>حامض الستريك</td><td>واكو</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>شركة دينا</td><td>كيا تك</td><td></td><td>الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء النانو</td></tr><tr><td>DiNa الذكاء الاصطناعي</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>نانوفلو كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء مجهزة بجهاز أخذ العينات الآلي</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>بروتين Dynabeads G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>حمض الفورميك</td><td>واكو</td><td>066-00461</td><td></td></tr><tr><td>HiQ Sil C18W-3</td><td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0.10 مممعرف * 100 مم</td></tr><tr><td>يودوأسيتاميد</td><td>واكو</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>ليبوفيكتامين 3000</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>الألوان الحية الجسد المضاد أحادي النسيلة (JL-8)</td> <td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>واكو</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>بولي (أوكسي إيثيلين) أوكتيل فينيل الأثير (ن = 9)</td></tr> <tr><td>معيار الببتيد</td><td>KYA Tech Co.</td><td>tBSA-04</td><td>الهضم التريبتيك من ألبومين مصل الأبقار</td></tr><tr><td>PP قارورة</td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>أنبوب عينة بلاستيكي</td></tr><tr><td>مثبط البروتياز كوكتيل</td><td>سيجما</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>بروتين برنامج</td><td>تجريبي Sciex</td><td>5034057</td><td>لتعريف البروتين</td></tr><tr><td>تسلسل الصف المعدل التربسين</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>التربسين</td></tr><tr><td>أورثوفاناديت الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي هيدرات فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>عمود المصيدة</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0.5 مم معرف * 1 مم</td></tr><tr><td>نظام TripleTOF 5600</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>هجين رباعي الأقطاب مطياف الكتلة الترادفي وقت الرحلة</td></tr><tr><td>تريس</td><td>واكو</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>توين -20</td><td>واكو</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

العديد من البروتينات داخل الخلايا تتفاعل جسديا وفقا لظروفها داخل الخلايا وخارج الخلية. في الواقع، تعتمد الوظائف الخلوية إلى حد كبير على تفاعلات البروتين والبروتين داخل الخلايا. ولذلك، فإن البحوث المتعلقة بهذه التفاعلات لا غنى عنها لتيسير فهم العمليات الفسيولوجية. يمكن التهطول المشترك للبروتينات المرتبطة بها، متبوعًا بتحليل الطيف الكتلي (MS)، تحديد تفاعلات البروتين الجديدة. في هذه الدراسة، قدمنا تفاصيل تقنية جديدة من المناعية هطول الأمطار السائلة الكروماتوغرافيا (LC)-MS / MS تحليل جنبا إلى جنب مع الهضم على الغشاء لتحليل التفاعلات بين البروتين والبروتين. هذه التقنية مناسبة للمناعة الخام ويمكن أن تحسن الإنتاجية من التحليلات البروتيومية. وقد عجلت البروتينات المؤتلفة الموسومة باستخدام أجسام مضادة محددة؛ بعد ذلك، تعرض علماء المناعة المناوئون على قطع غشاء الديفيلوريد البولي فينيليدين إلى الألكلة الاختزالية. بعد التجرب، تم تحليل بقايا البروتين المهضوم باستخدام LC-MS/MS. باستخدام هذه التقنية، تمكنا من تحديد العديد من البروتينات المرتبطة بالمرشح. وبالتالي، فإن هذه الطريقة مريحة ومفيدة لتوصيف التفاعلات الجديدة بين البروتين والبروتين.

من خلال الإجراء المذكور أعلاه، تم تحليل مضادات المناعة باستخدام LC-MS/MS (الشكل1). بعد استبعاد البروتينات المشتقة من البروتينات الخارجية (البروتينات من الأنواع الأخرى وIgGs)، تم تحديد17 بروتينًا في مضادات المناعة المرتبطة بالكالبين-6 (الجدول 1) وتم تحديد 15 بروتينًا في مضادات المناعة المرتبطة بـ GFP ( الجدول2). ومن بين البروتينات المرتبطة بالكالبين-6 والبروتينات المرتبطة بـGFP، تم تحديد 11 في كل ...

هنا، نقدم بروتوكول لتقنية الهضم على الغشاء لإعداد عينات لقياس الطيف الكتلي. تسهل هذه التقنية التحليل المريح للتفاعلات بين البروتين والبروتين.

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

البحث البروتين البروتين البروتين التفاعل لا غنى عنه لفهم العمليات الفسيولوجية في العديد من المجالات. في هذا الفيديو نقدم تقنية الهضم على الغشاء الذي يسمح للباحثين لإجراء تحليل شامل للبروتينات ملزمة من قبل مرض التصلب العصبي المتعدد بطريقة مريحة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تحسين إنتاجية التحليل البروتيني للمناعة الخام لأن فصل البروتينات بواسطة الجل البولي أكريلاميد الكهربائي ليس ضروريًا.تبدأ الاقتران الجسم المضاد إلى الخرز المغناطيسي، عن طريق خلط الأجسام المضادة لـ GFP مع الخرز في 500 ميكرولترات من الفوسفات العازلة سيترات. تدوير الخليط في 50 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الخرز المقترن ثلاث مرات مع العازلة الفوسفات سيترات تحتوي على 1٪ polysorbate 20.الخلايا المصابة بالLyse وفقا لاتجاهات المخطوطات. كشط الطبق ونقل lysate في أنبوب اختبار 1.5 ملليلتر. ثم مسح lysate عن طريق الطرد المركزي في 15، 000 x ز لمدة خمس دقائق وجمع supernatant.إعداد الخرز المغناطيسي غير المُوَمَّن بغسلها ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من عازل الفوسفات سيترات. بعد الغسيل النهائي، إزالة العازلة وإضافة الخلية lysate إلى الخرز. تدوير الخليط في 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.أداء فصل المغناطيسي على موقف مغناطيسي وجمع الخلية lysate. لربط البروتينات المستهدفة إلى الخرز المترافقة مع الغلوبولين المناعي ، ضع الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة خمس دقائق. تجاهل المخزن المؤقت citrate وإضافة الخلية lysate إلى الخرز.تدوير الخليط لمدة ساعة واحدة في 50 دورة في الدقيقة. لفصل البروتينات المستهدفة من البروتينات غير المستهدفة المجانية ، اغسل الخرز ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من عازل الفوسفات سيترات التي تحتوي على 1 ٪ من البوليسوربات 20. بعد الغسيل النهائي، إضافة 30 ميكرولترات من العازلة سيترات، والسماح للخرز الجلوس لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ل elute البروتينات المستهدفة.لتحضير الغشاء، قم بقطع أغشية PVDF إلى 3 ملليمترات من خلال قطع 3 ملليمترات باستخدام مقص جراحي تم تنظيفه قبل الاستخدام مباشرة. ضع قطعة من الغشاء على رقائق الألومنيوم وإضافة اثنين إلى خمسة ميكرولترات من الإيثانول إلى كل قطعة. قبل الأغشية جافة تماما، إضافة اثنين إلى خمسة ميكرولترات من بروتين الوميضة إلى كل قطعة والهواء الجافة حتى يصبح سطح الغشاء غير لامع.ثم نقل الأغشية إلى 1.5 ملليلتر أنابيب وتخزينها في أربع درجات مئوية. إذا كان استخدام على الفور، إضافة اثنين إلى 30 ميكرولترات من الإيثانول الذي سيجعلهم هيدروفيلي. إزالة الإيثانول مع ماصة، ولكن قبل أن تجف الأغشية، إضافة تماما 200 ميكرولترات من حل رد فعل DTT القائم على كل أنبوب، واحتضان لهم في 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد الحضانة، استبدال حل رد فعل مع 300 ميكرولترات من محلول iodoacetamide، واحتضان في الظلام لمدة 45 دقيقة. ثم غسل الأغشية مرتين مع الماء المقطر ومرة واحدة مع 2٪ الأسيتونيتريل من قبل دوامة لمدة عشر ثوان على الأقل. يمكن أن يكون العمل مع الأسيتونيتريل ذات الصلة بغشاء الغشاء الصلزي خطرًا للغاية.وينبغي دائما ارتداء قناع, نظارات وقفازات عند إجراء عملية الهضم على الغشاء. إعداد التربسين وفقا لاتجاهات المخطوطات، وإضافة 100 ميكرولترات من محلول رد فعل التربسين لكل غشاء. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للهضم.في اليوم التالي، نقل حل رد فعل إلى أنبوب 1.5 ملليلتر نظيفة، وإضافة 100 ميكرولترات من حلول الغسيل للغشاء. احتضان الغشاء في 60 درجة مئوية لمدة ساعتين، ثم جمع محلول الغسيل ومزجها مع حل رد فعل. إضافة آخر 100 ميكرولترات من محلول الغسيل إلى الغشاء و sonicate لمدة 10 دقائق.ثم جمع محلول الغسيل ومزجها مع حل رد الفعل. غطي أنبوب الاختبار بقطعة من الأفلام المختبرية واصنع ثقوب صغيرة في الفيلم بإبرة. جفف المحلّل باستخدام مُركز فراغي، واحلّ البقايا في 10 ميكرولترات من حمض فورميك 2٪.الطرد المركزي الأنبوب في 12، 000 س ز لمدة ثلاث دقائق، ونقل المابير في أنبوب عينة. تحليل العينة باستخدام مطياف كتلة مرتبطة نظام نانو LC / HPLC. وباستخدام هذا البروتوكول، تم تحديد 17 بروتينًا في المُعَد المناعي المرتبط بـ Calpain-6، و15 بروتينًا في المُعَدّة المناعية المرتبطة بـ GFP، و11 بروتينًا تم تحديدها في كلا الحالتين.من المهم ملاحظة أن الكشف عن جزء ببتيد عالي الدقة مطلوب لتحديد البروتين المرشح بشكل إيجابي. تم حذف البروتينات التي عجلت في lysate التعبير عن GFP وكذلك histones ، والبروتينات الخارجية والريبوسية من القائمة. غسل الأغشية قبل الهضم التريبتيك مع الماء المقطر و 2٪ الأسيتونتريل هو أهم خطوة في إجراء الهضم على الغشاء على البروتينات.باتباع هذه الطريقة، من الممكن التأكد من التهطال المشترك للبروتين المستهدف بإجراء تجارب أخرى، مثل التحلل المناعي وتحليل البقعة الغربية. هذه الطريقة البسيطة تسمح للباحثين باستكشاف التفاعلات الجديدة بين البروتين والبروتين مع تحليل مناسب وعالي الحساسية.

evaluation-proteinprotein-interactions-using-an-on-membrane-digestion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

هذا الفيديو يبين تحليل التجارب مع لاحقة من البروتين البروتين التفاعلات عن طريق استخدام الصغرى منقوشة السطوح. النهج توفر إمكانية الكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية ، ويجمع بين قدرات إنتاجية عالية مع إمكانية استخراج المعلومات الكمية.

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

لا غنى عن اختبار البروتين البروتين التفاعل لتشريح وظيفة البروتين. هنا ، نحن بتقديم...

الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر</em

يوضح هذا الفيديو مجمعات البروتين المترسبة المناعية المشتركة على غشاء PVDF لتحليل تفاعل البروتين والبروتين. تمت معالجة البروتينات المختزلة من المجمعات بالتربسين لشق البروتينات الفردية عند الببتيدات الأصغر ، ثم تم استخراج الببتيدات المتبقية من غشاء PVDF. ثم تم تجفيف الببتيد المسحوب المشتق من كلا البروتينين في المركب وإعادة تعليقه في تركيز منخفض من حمض الفورميك لمزيد من التحليل.

هضم البروتين على الغشاء لإعداد البروتينات المترسبة المناعية المشتركة لدراسات التفاعل

يوصف منهج الكيمياء الحيوية في الجسم الحي لتحديد البروتين البروتين التفاعلات (PPI) للبروتينات الغشاء. أسلوب يجمع بين البروتين عبر ربط، وتنقية تقارب ومطياف الكتلة، وقابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا أو الكائن الحي. مع هذا النهج، وحتى تحديد مثبطات مضخة البروتون عابرة يصبح ذلك ممكنا.

غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء في فيفو

هذا بروتوكول لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا استناداً إلى نظام المنسدلة avidin البيوتين مع الجدة للجمع بين تسلسلات اختراق الخلية. والميزة الرئيسية هو أن التسلسل المستهدفة هي المحتضنة مع الخلايا الحية بدلاً من الخلية ليساتيس وذلك سوف تحدث التفاعلات في سياق الخلوية.

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

يصف لنا بروتوكول للكشف عن المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء استخدام ربط لمستقبلات الفرز، سورتيلين، إلى حلقة لومينال الأولى من البروتين الناقل الجلوكوز، GLUT4، على سبيل مثال.

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

تفاعلات البروتين البروتين والبروتين-المستقلب حاسمة بالنسبة لجميع الوظائف الخلوية. هنا، نحن وصف بروتوكول يسمح تحليل موازية لهذه التفاعلات مع بروتين في الاختيار. لدينا بروتوكول الأمثل للثقافات الخلية النباتية، ويجمع بين انجذاب تطهير مع البروتين الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي وكشف المستقلب.

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

يحصل الرحلان الحراري المجهري على ثوابت ربط بسرعة بتكلفة مادية منخفضة. إما الرحلان الحراري المجهري المسمى أو الخالي من التسمية متاح تجاريا. ومع ذلك ، فإن الرحلان الحراري الخالي من الملصقات غير قادر على تنوع قياسات التفاعل التي يمكن إجراؤها باستخدام ملصقات الفلورسنت. نحن نقدم بروتوكولا لقياسات الرحلان الحراري الموسومة.

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

نقدم طريقه تجمع بين تنقيه البروتين الغشائي وأعاده التشكيل إلى أقراص البيتيغرافيه في خطوه واحده للكروماتوغرافي. وتستخدم السقالات الحيوية للحصول علي المرفق السطحي المباشر وقياس التفاعلات البروتينية والبروتينات عن طريق قياس التداخل الحيوي.

PeptiQuick ، خطوه واحده لدمج البروتينات الغشائية في أقراص البيتيلات الحيوية لاختبارات ربط البروتين الانسيابية

هنا هو بروتوكول لتحديد الدولة القلة من البروتينات الغشاء الذي يستخدم نظام غشاء الخلايا الأصلية نانو جسيمات بالاقتران مع المجهر الإلكتروني.

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

هنا ، نقدم بروتوكولا لتمكين التقاط وتحديد تفاعلات البروتين والبروتين الخاصة بالمرض من الخلايا والأنسجة الأصلية باستخدام المجسات الكيميائية وقياس الطيف الكتلي. يتم تحليل مجموعات بيانات التفاعل الناتجة من خلال نظام أساسي مخصص قائم على الويب للكشف عن اختلالات الشبكة الديناميكية وتغييرات المسار المرتبطة بالمرض.

رسم خرائط تفاعلات البروتين والبروتين المختلة في المرض

تعلم تقنية الهضم على الغشاء لتحليل تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام طيف الكتلة، حيث تزيد من الإنتاجية عبر إزالة الحاجة إلى الترحيل الكهربائي الهلامي.

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

استكشف المزيد من الفيديوهات