تصوير الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية بواسطة الضوء المترابطة والفحص المجهري للإلكترون الحجم

وتستخدم تقنية المجهر الإلكتروني هذا لإجراء الدراسات البيولوجية التي تتطلب مراقبة بنية ثلاثية الأبعاد. تقديم قضيب، عرض لاعب الميدان، وتخزين العينة قبل إعادة استعادة الصورة. Fx2 Asan هندست مراحل المسار التي تحفز على إزالة للفحص لزيادة اختبار الإلكترون من الهياكل المستهدفة ويمكن استخدامها لتحديد هدف معين من الفائدة.

تجمع هذه الجسيمات بين استخدام الضوء المترابط وتقنية المجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد للتحقيق في التفاعلات بين العضيات المُمَرَبة والخلايا المضيفة. 16 إلى 24 ساعة بعد transfection، وغسل بلطف الثقافة مع 250 ميكرولترات من 30 إلى 37 درجة مئوية حل التثبيت. استبدال بسرعة غسل مع 1.5 ملليلتر من حل التثبيت الطازجة، ووضع الثقافة على الجليد لمدة 30 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، شطف الخلايا مع ثلاث غسلات عشر دقائق في ملليلتر من الجليد البارد 0.1 0.1 صوديوم cacodylate العازلة في الغسيل. بعد الغسيل الأخير، إضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة 0 إلى 4 درجات مئوية 20 ملليمتر 20 محلول الجليسين إلى الطبق لاحتضان لمدة عشر دقائق على الجليد تليها ثلاث يغسل خمس دقائق مع ملليلتر واحد من الطازجة، الباردة 0.1 الصوديوم الكاكويدوليت كل غسل العازلة. المقبل، تسمية الخلايا مع 500 ميكرولترات من حل DAB الطازجة.

و حضن الخلايا على الجليد لمدة خمس إلى خمس وأربعين دقيقة تقريباً عندما تكون بقعة بني فاتح مرئية تحت مجهر ضوء مقلوب ، شطف الخلايا ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من الطازجة والباردة 0.1 صوديوم cacodylate العازلة لمدة عشر دقائق لكل غسل. ثم، استخدام المجهر المقلوب على النقيض من المرحلة لتصور تلطيخ DAB في تكبير 100 مرة أو أعلى ووضع علامة على الجزء السفلي من الزجاج حيث تقع المنطقة ذات الاهتمام.

بالنسبة لإعداد عينة المجهر الإلكتروني ، أول ما بعد إصلاح الخلايا مع ملليلتر واحد من 2 ٪ انخفاض أوسميوم تتراوكسيد لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. في نهاية التثبيت ، شطف الخلايا مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق ومليلتر واحد من الماء المقطر الطازج لكل غسل. قبل معالجة الخلايا بميليلتر واحد من محلول TCH الذي تمت تصفيته لمدة 20 دقيقة.

في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات في الماء المقطر كما أظهرت للتو وإصلاح الخلايا مع حضانة 30 دقيقة في 2٪ انخفاض أكسيد الأوسميوم. في نهاية التثبيت الثاني، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع الماء المقطر وتغطية الثقافة مع ملليلتر واحد من خلات أورانيل مائي 1٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي، غسل الخلايا ثلاث مرات مع الماء المقطر قبل تلطيخ مع ملليلتر واحد من 60 درجة مئوية سخنت المحلل التون اسبارتات الرصاص لمدة 30 دقيقة في فرن 60 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات في الماء المقطر. واحتضان الثقافة في سلسلة متدرج من 20 دقيقة 2 ملليلتر الإيثانول aliol. بعد التعرض الأخير 100٪ الإيثانول، احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في ملليلتر واحد من ثلاثة إلى واحد الإيثانول إلى انخفاض اللزوجة تضمين خليط المتوسطة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة، واستبدال المتوسطة مع ملليلتر واحد من الإيثانول واحد إلى واحد إلى انخفاض اللزوجة تضمين خليط المتوسطة لاحتضان آخر 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، استبدل الوسيط بميليلتر واحد إلى ثلاثة إيثانول إلى مزيج مُدمج منخفض لمدة 30 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. ثم، استبدال المتوسطة مع ملليلتر واحد من 100٪ اللزوجة المنخفضة تضمين المتوسطة بين عشية وضحاها، تليها تضمين العينة في 100٪ اللزوجة اللزوجة التضمين خليط لمدة 24 ساعة في 60 درجة مئوية.

بالنسبة لتحليل المجهر الإلكتروني للإرسال، في اليوم التالي، استخدم ميكروتوم فائقًا للحصول على 90 جزءًا سميكًا من نانومتر ومراقبة الشبكة تحت المجهر الإلكتروني انتقال في 200 كيلوفولت. قبل البدء في إعداد العينة، نظيفة أغطية الزجاج المغلفة أكسيد القصدير Indium مع التحريض لطيف في ايزوبروبانول لمدة 30 إلى 60 ثانية. في نهاية الهياج ، استنزف الكحول الزائد ووضع الأغطية في بيئة خالية من الغبار.

عندما تكون الأغطية جافة، استخدم مغطي البلازما لتوهج تصريف الأغطية لمدة دقيقة واحدة. ثم إدراج الأغطية في حامل الركيزة ووضع حامل الركيزة في قارب سكين. للحصول على عينات لفحص المجهر الإلكتروني، أدخل كتلة العينة المضمنة في حامل العينة من الميكروفات الفائقة.

ووضع حامل في كتلة التشذيب. استخدام شفرة حلاقة لتقليم بعيدا الراتنج الزائد حول الموقف المستهدف بحيث أن وجه كتلة يكتسب شكل شبه منحرف أو مستطيلة. يجب أن تكون الحواف الرائدة والزائدة متوازية تمامًا مع بعضها البعض.

ليس من السهل الحصول على عدد كبير من المقاطع التسلسلية. ومع ذلك، يجب أن يكون لديك الحواف الرائدة وحافات زائدة موازية تماما. بعد ذلك، أدخل حامل العينة في ذراع الميكراتومية الفائقة.

ضع سكين الماس في حامل السكين ، وملء قارب السكين بالماء المقطر المصفى. ثم، دفع بعناية مقبض الحامل لضبط موقف الناقل بحيث حافة الأغطية قريبة من السكين. بعد الحصول على العينة، ووقف عملية اقسام، ببطء فتح المسمار لقط الأنبوب واستنزاف قارب المياه.

عند اكتمال عملية تجميع الشريط، قم بإزالة الركيزة بمقبض جهاز التحامل وجفف الشريط. استخدام البلازميدات الموسومة وراثيا التعبير عن البروتينات من الاهتمام، ويسمح لتحديد الخلايا المستهدفة عبر المصابين بعد تلطيخ للبروتينات الموسومة. ويمكن بعد ذلك المجهر الإلكتروني الخفيف المترابط أن تستخدم لتصور مزيد من ثقافة الخلية المسمى.

على سبيل المثال، يتم ملاحظة البقعة الداكنة التي تولدها SCO1-APEX2 حصريًا في الفضاء المشترك بين الميتوكوندريا وليس في مساحة المصفوفة للميتوكوندريا. رمز الخلايا المصابة مع كل SCO1-APEX2 وHRP-KDEL plasmids التعبير عن إشارة الإلكترون عالية الكثافة في الفضاء intermembran في الميتوكوندريا وشوكولوم endoplasmic. ومع ذلك، لا يوجد تلطيخ إندوبلاسميكي للتشنج في الخلايا التي يتم نقل المصابين SCO1-APEX2 فقط.

للتصوير التسلسلي عن طريق المسح المجهري الإلكترون، يتم إنشاء نظرة عامة على صورة مجموعة كاملة باستخدام كاشف الإلكترون backscatter على مساحة كبيرة. وبعد ذلك، توضع المنطقة موضع الاهتمام في القسم الأول وتُنشر في جميع الأقسام الأخرى. وأخيراً، يتم تصوير المنطقة ذات الاهتمام التي تحتوي على خمس خلايا مستهدفة بخمسة بيكسلات تصوير نانومترية.

التكبير يكشف عن هياكل فرعية مفصلة مثل جهاز غولجي، الميتوكوندريا، وشوكولوم endpolasmic. التصوير التسلسلي يكشف بوضوح أن اتصالات إندوبلاسميك النتكولوم-الميتوكوندريا تحدث على مختلف ال الطائرات z- الوميض. يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد موقع بنية مستهدفة محددة باستخدام الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني للتحقيق في آثار تعديل هوية محددة.

ويمكن استخدام هذه التقنيات تلطيخ جنبا إلى جنب مع حجم المجهرية الإلكترونية لأوسع نطاق EM للتحقيق التفاعلات الخلوية وخاصة في يوروفيروس. تذكر الجلوتارالدهيد، وأيضا عنتيterocide وTCH هي سامة جدا، لذلك تأكد من ارتداء الملابس الواقية والعمل في غطاء الدخان عند استخدام هذه المواد.