التسجيلات الكهرولوجية للتيارات الأيونية أحادية الخلية تحت ضغط القص المحدد جيداً

والهدف من هذا البروتوكول هو وصف تعديل غرفة تدفق لوحة موازية لاستخدامها في التحقيق في الوقت الحقيقي تفعيل قنوات أيون mechanosensitive عن طريق الإجهاد القص.

استخدام غرفة تدفق لوحة موازية تعديل يمكن أن تساعد الباحثين الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالاستجابة الوظيفية للقنوات الأيونية الحساسية لشد القص. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للتحقيق في الوقت الحقيقي أن تتدفق قنوات أيونات نشطة في غرفة تدفق لوحة متوازية يسهل تجميعها وقابلة لإعادة الاستخدام. لبدء الإجراء، وتطبيق طبقة رقيقة من محلول مسترومر سيليكون حول حواف الفضاء مستطيلة من قطعة C، ووضع بلطف على الزجاج غطاء مستطيلة، قطعة D، مباشرة على حل الدرهم لتغطية تماما الفضاء مستطيلة مفتوحة من قطعة C.Carefully مسح فائض محلول السيليكون elastomer.

ثم، كرر الإجراء للتمسك الزجاج غطاء مستطيلة، قطعة F، إلى الجزء السفلي من القطعة E والسماح حل مِلَغ سيليكون لعلاج بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. الآن، تجميع غرفة تدفق MPP عن طريق وضع تسلسلي كل قطعة على رأس السابقة، بدءا من الغرفة السفلية، قطعة E، ثم قطعة C، قطعة B، تليها قطعة A على الجزء العلوي. المقبل، محاذاة ثقوب المسمار من كل قطعة في زوايا وبرغي بإحكام القطع معا لمنع تسرب من حدوث أثناء إدارة تدفق إلى غرفة تدفق MPP.

في لوحة من ستة بئر، ضع أربعة إلى خمسة، 12 ملليمتر تغطية الدوائر الزجاجية في كل بئر. حفظ الخلايا بين 10٪ و 30٪ التقاء، بحيث يمكن الوصول إلى الخلايا المفردة للتسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية. في وقت لاحق، احتضان الخلايا في ظل ظروف الثقافة القياسية لمدة لا تقل عن ساعتين للسماح للخلايا بالتمسك، وليس أكثر من 24 ساعة، كما الخلايا البطانية سوف تصبح مسطحة ويصعب تصحيحها عندما seeded في subconfluency لأكثر من 24 ساعة.

بعد ذلك، قم بإزالة غطاء زجاجي يحتوي على الخلايا الملتزم بها من بئر من لوحة الستة جيداً وشطف بسرعة في برنامج تلفزيوني. ثم، نقل غطاء الزجاج مع الخلايا إلى طبق بيتري 35 ملليمتر يحتوي على مليلترين من محلول BAF الكهربائي الفيزيولوجي. قم بنقل زجاج الغطاء مع الخلايا إلى غرفة تدفق MPP على الفور.

نقل دائرة غطاء الزجاج إلى الزجاج غطاء مستطيل، قطعة D، والتي يتم الالتزام بها إلى قطعة C من غرفة تدفق MPP. أضف حل BAF لغمر دائرة الزجاج الغطاء والخلايا تمامًا. في وقت لاحق، موقف دائرة الزجاج غطاء على قطعة D بحيث الخلايا سوف تكون تمشيا مع فتحات شق قطعة B.Ensure أن دائرة الغطاء الزجاجي يتمسك قطعة D من خلال التصاق الزجاج حل لتجنب تعطيل موقف دائرة الزجاج غطاء من قبل تطبيق تدفق.

ثم، تجميع غرفة تدفق MPP عن طريق الشد القطع معا في الترتيب المناسب. نقل الغرفة إلى مرحلة المجهر و perfuse على الفور الغرفة مع حل BAF. بعد ذلك، تحديد خلية سليمة مع الحدود المظلمة ونواة واضحة للتجربة.

تجنب الخلايا التي تبدو وكأنها تُزَمّر أو الخلايا التي تكون على اتصال مع الخلايا الأخرى. للسيطرة على الإجهاد القص، قم بإعداد نظام ضخ الجاذبية من خلال ربط أسطوانة حقنة متدرجة بـ 30 ملليلتر بقفل لوار ثلاثي الاتجاه مزودًا بمواسير ميكروبور. بعد ذلك، قم بإرفاق الأسطوانة المتخرجة بقفص فاراداي المحيط بمنصة الفيزيولوجيا الكهربائية باستخدام شريط مزدوج الوجهين.

قبل إدخال الأنابيب في غرفة MPP ، قم بملء الحقنة والأنابيب مسبقًا بمحلول BAF. ثم، أدخل الأنابيب في فتحة مدخل غرفة تدفق MPP من قطعة A.Pre-ملء غرفة تدفق MPP مع الحل، بحيث يتم إزالته في خزان فراغ. وقف تدفق إلى الغرفة وإعادة ملء الاسطوانة المتخرجة إلى أعلى علامة.

حساب معدل التدفق يدويا باستخدام ساعة توقيت عن طريق السماح للحل بالتدفق عبر الغرفة في ارتفاع اسطوانة حقنة معينة. رفع أو خفض حقنة لتغيير تدفق وحساب الإجهاد القص في غرفة موازية باستخدام هذه المعادلة. كرر هذه العملية حتى يتم العثور على المستوى المطلوب من الإجهاد القص.

وفي وقت لاحق، نقل غرفة مجمعة تحتوي على خلايا ملتصقة إلى مرحلة المجهر من جهاز تلاعب الفيزيولوجيا الكهربائية. وأدخل الأنابيب، مليئة مسبقا مع حل BAF، في حفرة من قطعة A.Then، ملء الغرفة وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من حل BAF، في وقت واحد. بمجرد الحصول على تكوين التصحيح المطلوب بنجاح، تسمح التيارات قناة لتحقيق الاستقرار في حمام ثابت في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد أن استقرت التيارات ، قم بتطبيق القص بطريقة تدريجية ، مما يسمح للتيار المتزايد بالثبات قبل الخطوة التالية لزيادة الإجهاد. إزالة التعرض القص للخلايا عن طريق وقف تدفق إلى الغرفة، مما يسمح التيارات قناة الحساسية للعودة إلى التيارات الأساسية لوحظ في الحمام ساكنة. يظهر هنا هو تمثيل الخام تسجيل Kir الحالي من الماوس الرئيسي mesenteric خلية البطانية مع تسرب خطية بارزة التيار.

تم تطبيق منحدر من سالب 140 إلى 40 ملليفولت موجبة على التصحيح أكثر من 400 مللي ثانية. تسرب التيار يمنع تحليل نشاط قناة كير الحقيقي. لطرح تسرب الحالية، أولاً حساب سلوك الميل الخطي لتيار التسرب.

متعددة G المنحدر من قبل الفولتية المقابلة من تتبع الخام كامل لمؤامرة تسرب الحالية على البيانات الخام. يجب أن تراكب الخط تسرب خطي خارجي بالضبط. ثم طرح الحالي تسرب رسم من تتبع كامل بحيث تيار الخارج الخطي هو حول picoamperes صفر في picofarad، ويمكن تحليل تيار Kir الحقيقي.

أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء هو وضع بشكل صحيح غطاء الزجاج في الغرفة بحيث الخلايا يمكن الوصول إليها للتجارب. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن زلة الغطاء يتم التقيد بشكل كاف إلى قطعة D، بحيث تدفق السوائل لا تعطل غطاء الزجاج تحتوي على الخلايا.