قياس الإرشاد المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي المخنث

توفر هذه الطريقة أداة للعلماء لدراسة العوامل الوراثية البيئية التي تؤثر على هجرة الحيوانات المنوية وسلوكها في بيئاتها الأصلية داخل الجهاز التناسلي الأنثوي. وتنبع الميزة الرئيسية لهذه التقنية من البشرة الشفافة للـ C.elegans، والتي تسمح للمجربين بتصور حركة الحيوانات المنوية وتسجيلها بسهولة في الحيوانات الحية. للبدء، استخدم قطف دودة مصنوعة من ماصة باستور وسلك بلاتيني بالارض على نهاية واحدة لاختيار 20 إلى 30 L4 مرحلة hermaphrodites، ووضعها بلطف على لوحة NGM المصنفة ستة سنتيمترات.

احتضان hermaphrodites في 20 درجة مئوية لمدة 28 إلى 30 ساعة. بعد ذلك، جعل لوحة تلطيخ الذكور. استخدام نهاية قضيب اثارة الزجاج لكشط E.coli من حديقة البكتيريا من لوحة بذر، وإيداعها على وسط لوحة NGM غير المصنفة، مما يجعل نقطة الطعام من خمسة إلى سبعة ملليمترات قطرها.

مزيج معا اثنين من ميكرولترات من صبغة ميتويتو واحد ميليلي في DMSO و 10 ميكرولترات من M9 العازلة في أنبوب microcentrifuge. الماصات كل من محلول صبغ الميتو على نقطة الغذاء على لوحة تلطيخ الذكور. ضع الطبق في الظلام حتى يجف لمدة 30 دقيقة.

تحت المجهر، على لوحة تحتوي على واحد إلى ثلاثة أيام الكبار C.elegans، وتحديد الذكور من قبل ذيلهم على شكل مروحة. اختيار ما يقرب من 100 الذكور إلى نقطة الطعام الملون ميتو صبغ على لوحة تلطيخ الذكور. التفاف لوحة في رقائق الألومنيوم، واحتضان بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.

في اليوم الثاني، نقل الذكور الملونين على لوحة NGM مبذرة جديدة لتنظيف البكتيريا الزائدة الملطخة بصبغة الميتو. إبقاء لوحة في الظلام حتى التزاوج. لجعل لوحة التزاوج، على لوحة NGM غير المصنفة، بالتنقيط اثنين من ميكرولترات من خليط الإشريكية القولونية سميكة.

انتظر حوالي 10 إلى 15 دقيقة حتى تجف البكتيريا السميكة لتشكل نقطة تزاوج. في انتظار أن يجف لوح التزاوج، اخلطي 300 ميكرولترات من وزن 1٪ حسب حجم التريكين، 300 ميكرولترات من وزن 0.1٪من قبل رباعيات التراميسول، و 900 ميكرولترات من M9. نقل 600 ميكرولترات من محلول التتراميسول/تريكابيل إلى زجاج الساعة. نقل 12 إلى 15 hermaphrodites التقطت في اليوم الأول في حل tetramisole / tricaine على زجاج الساعة.

ضع النصف السفلي من طبق بيتري فوق زجاج الساعة للحفاظ على تغطيته من التبخر ، واحتضان لمدة 30 دقيقة لشل حركة hermaphrodites. بعد ذلك ، استرداد لوحة NGM المصنفة التي تحتوي على الذكور الملونين من الظلام ، واختيار 50 إلى 60 ذكرا ملطخة على نقطة التزاوج المجففة على لوحة التزاوج. تخزين لوحة في الظلام.

بعد أن يتم شل حركة hermaphrodites ، استخدم ماصة باستور الزجاجية لالتقاط hermaphrodites المُشلول من زجاج الساعة. تجنب مص hermaphrodites وراء الجزء الضيق من الماصات. نقل hermaphrodites على لوحة NGM غير المصنفة.

إزالة السائل قدر الإمكان، والسماح للسائل الزائد الجافة. بمجرد أن تبخرت جميع السائل المرئي ، نقل hermaphrodites تخدير على نقطة التزاوج مع الذكور الملون. احتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة للسماح التزاوج.

إذا كان تقييم توزيع الحيوانات المنوية مرغوبًا ، فانقل hermaphrodites المتزاوج إلى لوحة NGM مبذرة والسماح لهم بالراحة لمدة ساعة واحدة قبل التركيب للتصور. لتركيب الديدان للتصور، بالتنقيط الأول 10 إلى 15 ميكرولترات من حل tetramisole/tricaine على لوحة agarose المعدة 2٪، ونقل hermaphrodites تزاوج في الحل على لوحة. ضع غطاء على الديدان.

جبل الشريحة على مجهر تستقيم مجهزة epifluorescence، ووضع الدودة بحيث كل من الفرج والحيوانات المنوية واحدة هي في العرض. التركيز على الصورة من خلال التركيز على مركز الحيوانات المنوية. تحقق من التعرض لكل من قنوات DIC وTRITC.

في DIC، هياكل دودة الداخلية واضحة للعيان. في TRITC، الحيوانات المنوية الفردية مرئية كما بونكتا متميزة. الحصول على صور DIC و fluorescence لكل رحم.

لالتقاط مقاطع فيديو بفاصل زمني، حدد أولاً موقع الهرمافروديت التي تحتوي على منوية تحمل علامات داخل الرحم. في لوحة الاكتساب، اضبط الفواصل الزمنية للحصول على الصورة إلى 15 إلى 30 ثانية، ومدة الاكتساب إلى 10 إلى 20 دقيقة لكل رحم. ثم انقر فوق تشغيل للحصول على الصور الفاصل الزمني في قنوات DIC وTRITC.

بدءا من الفرج على نهاية واحدة والحيوانات المنوية من ناحية أخرى، وتقسيم الرحم إلى ثلاث مناطق، مع منطقة تحتوي على الفرج والمنطقة الثلاثة التي تحتوي على الحيوانات المنوية. عد يدويا عدد الحيوانات المنوية في كل ثلث الرحم، والإبلاغ عن عدد في كل منطقة في المئة من مجموع الحيوانات المنوية في الرحم بأكمله. إذا لزم الأمر، استخدم جدول البحث لضبط شدة إشارة صور قناة TRITC بحيث يمكن أن يكون كل من الحيوانات المنوية مرئيًا ومقَدَّمًا.

لتتبع الحيوانات المنوية في الصور الفاصلة بين الوقت، استخدم برنامج فيجي للتحليل. استخدم الدالة استيراد تنسيقات حيوية لاستيراد الصور من سلسلة زمنية واحدة كـ هوبركاكس. ثم انقر فوق الإضافات، والتتبع، ثم دليل التعقب.

في مربع الحوار المفتوح، حدد أداة TrackMate في شريط الأدوات فيجي. انقر نقراً مزدوجاً على الحيوانات المنوية التي سيتم تعقبها. انقر داخل الدائرة الخضراء ظهرت مع خطوط متقطعة، واسحب إلى الموضع المطلوب.

انقر على الدائرة مرة أخرى. يتحول الخط الأخضر المتقطع إلى خط أخضر صلب. في وقت واحد ضرب مفاتيح التحول وL لتشغيل على وضع التتبع.

الانتقال إلى الإطار التالي في سلسلة الفاصل الزمني. لتعيين الموقع الجديد للحيوانات المنوية المتعقبة في الإطار الجديد، قم بتمرير الماوس فوق النقطة الجديدة واضغط على المفتاح A. يظهر المتعقب في الموقع الجديد، ويظهر خط، يربط الموقع الذي تم وضع المتعقب فيه في الإطار السابق.

كرر نفس الإجراء لبقية الإطارات. بعد اكتمال التتبع، انقر فوق تحليل في مربع الحوار TrackMate لإنشاء البيانات المطلوبة. لحساب السرعة، قم بتقسيم طول المسار الكلي للحيوانات المنوية على الوقت المنقضي.

لحساب السرعة المتجهية، رسم خط من خلال الرحم بدءا من الفرج، مشيرا نحو الحيوانات المنوية. استخدم أداة الخط لقياس المسافة التي هاجرها الحيوان المنوي على طول هذا الخط من بداية التتبع إلى نهايته. تقسيم هذه المسافة على الوقت المنقضي.

تشير القيم السلبية إلى أن الحيوانات المنوية قد هاجرت بعيداً عن الحيوانات المنوية. لتسجيل تكرار الانعكاس، عد عدد المرات التي قام خلالها تتبع الحيوانات المنوية بتوليد زاوية أقل من 90 درجة خلال ثلاثة إطارات زمنية متتالية. في هذا البروتوكول، كانت الديدان الذكرية الضباب-2 q71 ملطخة بصبغة الميتو وتزاوجت مع الهرمفروديتس N2 من النوع البري.

السنكة التناسلية هيرمافروديت البالغ اثنين من الأسلحة التي هي صور مرآة لبعضها البعض. عند التزاوج، يتم إيداع الحيوانات المنوية المسماة في رحم هيرمافروديت من خلال الفرج. الحيوانات المنوية تتحرك حول الأجنة النامية داخل الرحم، نحو الحيوانات المنوية، حيث يتم تخزينها حتى الإخصاب.

تم تقسيم الرحم hermaphrodite إلى ثلاث مناطق لتحديد كمية توزيع الحيوانات المنوية والهجرة. لتقييم سرعة الحيوانات المنوية وتواتر الانعكاس، تم تتبع الحيوانات المنوية فقط في المنطقة الثانية من خلال صور الفاصل الزمني. الحيوانات المنوية في المنطقة الأولى، بدءا من الفرج، والمنطقة الثالثة، بما في ذلك الحيوانات المنوية، تميل إلى التحرك في نمط دائري.

الحيوانات المنوية التي تميزت النقاط الحمراء والزرقاء كان سرعة الحيوانات المنوية وعكس تردد كمي. عند تحديد كمية توزيع الحيوانات المنوية في الرحم، التوجيه السليم الحيوانات المنوية باستخدام نوع البرية N2 hermaphrodites والضباب-2 q71 الذكور أدى إلى ما يقرب من 90٪ من الحيوانات المنوية المسمى الوصول إلى الحيوانات المنوية. لا ينبغي أن تحسب البيانات إذا كان التزاوج يؤدي إلى عدد قليل جدا من الحيوانات المنوية في الرحم أو الكثير من الحيوانات المنوية في الرحم، وملء كل شق.

من المهم أن يتم التعامل مع الحيوانات بلطف أثناء كل خطوة نقل ، وأن يتم شل الهرمفروديتس تماما ، وأن يتم حماية الصفائح والديدان التي تحتوي على صبغة ميو من الضوء. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة وتجارب الضربة القاضية الجينية أو التجارب على التعرض للمواد الكيميائية أو التجارب البيئية أو الكيميائية، أو غيرها من التلاعبات لتحديد العوامل التي قد تنظم ترحيل الحيوانات المنوية. وقد مكنتنا هذه التقنية من تحديد البروستاجلاندين محددة التي هي مهمة لتوجيه الحيوانات المنوية إلى البويضة.

يتم تصنيع هذه البروستاجلاندين عن طريق آلية غير تقليدية يمكن حفظها في الثدييات العليا. تتراميسول, تريكين, DMSO هي الجلد والعين المهيجات، وقد يكون لها آثار سامة في جرعات عالية. من المهم ارتداء معدات الحماية المناسبة عند التعامل مع أي مواد كيميائية.