تحليل توطين snRNA Spliceosomal في خلايا الهيلا البشرية باستخدام الحقن المجهري

هنا قمنا بتطبيق الحقن المجهري من الرنا الفلورية المسمى للكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبي التي هي ضرورية لتوطين RNAs النووية قصيرة في الهياكل النووية تسمى الهيئات Cajal. هذه التقنية لها ميزتان رئيسيتان. أولاً، يمكن تطبيقه على RNAs قصيرة التي يصعب خلاف ذلك تسمية وتتبع.

وثانيا، فإنه يسمح بالفحص السريع للتسلسلات المختلفة واختبار دورها في تعريب الحمض النووي الريبي. قبل يوم واحد من الحقن المجهري، بذور HeLa أو الخلايا الأخرى الملتزمة على 12 ملليمتر يغطي أن تصل إلى 50٪ التقاء في وقت الحقن المجهري. للبدء ، ضع غطاءً معدًا في وسط طبق بيتري ، وأضف الخلايا واثنين ملليمترات من وسائل الإعلام الثقافية.

في اليوم التالي، ضع طبق بيتري المليء بالخلايا على خشبة المجهر. باستخدام microloader، تحميل ثلاثة ميكرولترات من خليط snRNA في الإبرة وتثبيت الإبرة في حامل الحقن المجهري في زاوية 45 درجة فيما يتعلق سطح طبق بيتري. استخدام هدف مسافة طويلة 10X للعثور على الإبرة.

أولا، تعيين سرعة الخشنة على حاقن وخفض إبرة حتى اللمسات على المتوسطة الثقافة. باستخدام مناظير المجهر، والعثور على النقطة المضيئة التي هي المكان الذي تلامس الإبرة المتوسطة الثقافة. تغيير السرعة إلى غرامة وخفض مزيد من الإبرة في حين تبحث في المجهر حتى يتم رصد طرف الإبرة.

حرك الإبرة في منتصف الحقل المرئي والتبديل إلى هدف مسافة طويلة 40X. بعد ذلك، حدد الخلية وتحريك الإبرة فوق الخلية. تعيين الضغط والوقت للاتصال الخلية.

نقل الإبرة إلى أسفل في الخلية ومن ثم تعيين الحد الأدنى من micromanipulator. تعيين الحد الأدنى هو الجزء الأكثر أهمية من البروتوكول. لأن سطح الغطاء ليس مثاليا ولأن كل خلية مختلفة، سيكون لديك لتعيين الحد الأدنى عدة مرات خلال جلسة الحقن.

بعد ذلك، قم بتحريك الإبرة مرة أخرى فوق الخلية واضغط على زر الحقن على عصا التحكم في الحقن. سوف الإبرة تتحرك تلقائيا داخل الخلية إلى المكان الذي يتم تعيين الحد لحقن المزيج RNA. لإنهاء, اضغط على زر القائمة على حاقن وإزالة إبرة من حامل.

ثم قطع الأنبوب من حاقن قبل إيقاف عن حاقن وmicromanipulator. بعد الحقن المجهري ، إعادة الخلايا إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.

إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة مع 4٪ شبه شكلي في أنابيب 0.1 الضرس في 6.9 pH. ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع درجة حرارة الغرفة PBS. إذا تم تحليل توطين snRNA فقط ، شطف الخلايا في الماء لفترة وجيزة وجبل في وسط تصاعد مع DAPI.

في حالة توطين البروتين إضافية، permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وصمة عار لهم مع الأجسام المضادة الابتدائية والثانوية المناسبة كما هو مبين في بروتوكول النص. ثم شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وشطف مرة واحدة في الماء.

بعد ذلك، قم بتحميل الخلايا في متوسطة تحميل مع DAPI. عندما تكون جاهزة للصورة، استخدم نظام مجهري الفلوريسين الراقية المجهز بهدف الغمر للحصول على الصور. وبمجرد تحديد الخلايا المجهرية، قم بجمع كومة من 20 مقطعًا Z مع 200 خطوة من نانومتر Z لكل عينة وتخضع للفك الضوئي الرياضي.

لتحديد حجم الإشارة الفلورسنت، قم أولاً بفتح صورة المجهر في ImageJ وتقسيم القنوات إلى نوافذ. مزامنة الإطارات بواسطة أداة نافذة مزامنة. المقبل، رسم المنطقة من الاهتمام حول الجسم Cajal التي حددتها اللوين مناعة.

قياس شدة إشارة snRNA في ROI المحدد للملف. تحديد شدة الفلورية snRNA في العائد على الاستثمار وضعت عشوائيا في النوى. حفظ القيم المقاسة وحساب نسبة إشارة RNA في الجسم Cajal وnucleoplasm.

في هذه الدراسة، يتم تحديد الفلورسنت المسمى snRNas microinjected من أجل مراقبة نقلها داخل الخلية. لاختبار ما إذا كان موقع SM مهم لتراكم الجسم Cajal، snRNA تفتقر إلى موقع SM هو microinjected مباشرة في النواة. حقن في السيتوبلازم بمثابة عنصر تحكم في حين أن طول كامل snrna هو microinjected لتكون بمثابة سيطرة إيجابية.

بعد الحضانة ، يتم إصلاح الخلايا الدقيقة ويتم تصور لفائف علامة الجسم Cajal بواسطة الفلوروس المناعية غير المباشرة. كامل طول snRNA تراكمت في الهيئات Cajal بعد كل من حقن النووية والسيتوبلازمية. في المقابل، snRNA تفتقر إلى موقع SM ظلت في السيتوبلازم بعد الحقن المجهري في هذه المقصورة في حين أن الحقن المجهري النووي من snRNA دون موقع SM يكشف أن تسلسل الربط SM مهم لتوطين الجسم Cajal لأن هذا snRNA يبقى في النواة ولكن لا تتراكم في الهيئات Cajal.

في بعض الأحيان ميكروجينكشن في مقصورة خلوية واحدة فقط فشل وخدع Dextran 70 كيلودالون يمكن العثور عليها في كل من النواة والسيتوبلازم. يتم تجاهل هذه الخلايا من تحليل إضافي. على الرغم من حقيقة أن يتم تخزين snRNAs المسمى الفلورسنت في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية قبل الحقن، يمكن أن يحدث تدهور الحمض النووي الريبي.

لا يتم نقل الرنا المتدهورة حقن في السيتوبلازم في النواة ويبقى موضعية في السيتوبلازم. وينبغي التخلص من هذا snRNA وينبغي توليف snRNA جديدة. من المهم ضبط الحقن بشكل صحيح والضغط التعويضي لنوع الخلية.

وكما قال من قبل، وضع الحد الأدنى الصحيح لحقن الخلية أمر ضروري للضجين المجهري جيدة. يرجى تذكر أن الفينول- الكلوروفورم المستخدمة أثناء عزل الحمض النووي الريبي أمر خطير وأن إبرة الحقن المجهري هي كائن حاد. كن حذرا عند التعامل مع هذه المواد.