تحليل توطين snRNA Spliceosomal في خلايا الهيلا البشرية باستخدام الحقن المجهري
August 6th, 2019
التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs spliceosomal هي عملية معقدة تنطوي على مختلف المقصورات الخلوية. هنا، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت من أجل رصد نقلها داخل الخلية.
هنا قمنا بتطبيق الحقن المجهري من الرنا الفلورية المسمى للكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبي التي هي ضرورية لتوطين RNAs النووية قصيرة في الهياكل النووية تسمى الهيئات Cajal. هذه التقنية لها ميزتان رئيسيتان. أولاً، يمكن تطبيقه على RNAs قصيرة التي يصعب خلاف ذلك تسمية وتتبع.
وثانيا، فإنه يسمح بالفحص السريع للتسلسلات المختلفة واختبار دورها في تعريب الحمض النووي الريبي. قبل يوم واحد من الحقن المجهري، بذور HeLa أو الخلايا الأخرى الملتزمة على 12 ملليمتر يغطي أن تصل إلى 50٪ التقاء في وقت الحقن المجهري. للبدء ، ضع غطاءً معدًا في وسط طبق بيتري ، وأضف الخلايا واثنين ملليمترات من وسائل الإعلام الثقافية.
في اليوم التالي، ضع طبق بيتري المليء بالخلايا على خشبة المجهر. باستخدام microloader، تحميل ثلاثة ميكرولترات من خليط snRNA في الإبرة وتثبيت الإبرة في حامل الحقن المجهري في زاوية 45 درجة فيما يتعلق سطح طبق بيتري. استخدام هدف مسافة طويلة 10X للعثور على الإبرة.
أولا، تعيين سرعة الخشنة على حاقن وخفض إبرة حتى اللمسات على المتوسطة الثقافة. باستخدام مناظير المجهر، والعثور على النقطة المضيئة التي هي المكان الذي تلامس الإبرة المتوسطة الثقافة. تغيير السرعة إلى غرامة وخفض مزيد من الإبرة في حين تبحث في المجهر حتى يتم رصد طرف الإبرة.
حرك الإبرة في منتصف الحقل المرئي والتبديل إلى هدف مسافة طويلة 40X. بعد ذلك، حدد الخلية وتحريك الإبرة فوق الخلية. تعيين الضغط والوقت للاتصال الخلية.
نقل الإبرة إلى أسفل في الخلية ومن ثم تعيين الحد الأدنى من micromanipulator. تعيين الحد الأدنى هو الجزء الأكثر أهمية من البروتوكول. لأن سطح الغطاء ليس مثاليا ولأن كل خلية مختلفة، سيكون لديك لتعيين الحد الأدنى عدة مرات خلال جلسة الحقن.
بعد ذلك، قم بتحريك الإبرة مرة أخرى فوق الخلية واضغط على زر الحقن على عصا التحكم في الحقن. سوف الإبرة تتحرك تلقائيا داخل الخلية إلى المكان الذي يتم تعيين الحد لحقن المزيج RNA. لإنهاء, اضغط على زر القائمة على حاقن وإزالة إبرة من حامل.
ثم قطع الأنبوب من حاقن قبل إيقاف عن حاقن وmicromanipulator. بعد الحقن المجهري ، إعادة الخلايا إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة مع 4٪ شبه شكلي في أنابيب 0.1 الضرس في 6.9 pH. ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع درجة حرارة الغرفة PBS. إذا تم تحليل توطين snRNA فقط ، شطف الخلايا في الماء لفترة وجيزة وجبل في وسط تصاعد مع DAPI.
في حالة توطين البروتين إضافية، permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وصمة عار لهم مع الأجسام المضادة الابتدائية والثانوية المناسبة كما هو مبين في بروتوكول النص. ثم شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وشطف مرة واحدة في الماء.
بعد ذلك، قم بتحميل الخلايا في متوسطة تحميل مع DAPI. عندما تكون جاهزة للصورة، استخدم نظام مجهري الفلوريسين الراقية المجهز بهدف الغمر للحصول على الصور. وبمجرد تحديد الخلايا المجهرية، قم بجمع كومة من 20 مقطعًا Z مع 200 خطوة من نانومتر Z لكل عينة وتخضع للفك الضوئي الرياضي.
لتحديد حجم الإشارة الفلورسنت، قم أولاً بفتح صورة المجهر في ImageJ وتقسيم القنوات إلى نوافذ. مزامنة الإطارات بواسطة أداة نافذة مزامنة. المقبل، رسم المنطقة من الاهتمام حول الجسم Cajal التي حددتها اللوين مناعة.
قياس شدة إشارة snRNA في ROI المحدد للملف. تحديد شدة الفلورية snRNA في العائد على الاستثمار وضعت عشوائيا في النوى. حفظ القيم المقاسة وحساب نسبة إشارة RNA في الجسم Cajal وnucleoplasm.
في هذه الدراسة، يتم تحديد الفلورسنت المسمى snRNas microinjected من أجل مراقبة نقلها داخل الخلية. لاختبار ما إذا كان موقع SM مهم لتراكم الجسم Cajal، snRNA تفتقر إلى موقع SM هو microinjected مباشرة في النواة. حقن في السيتوبلازم بمثابة عنصر تحكم في حين أن طول كامل snrna هو microinjected لتكون بمثابة سيطرة إيجابية.
بعد الحضانة ، يتم إصلاح الخلايا الدقيقة ويتم تصور لفائف علامة الجسم Cajal بواسطة الفلوروس المناعية غير المباشرة. كامل طول snRNA تراكمت في الهيئات Cajal بعد كل من حقن النووية والسيتوبلازمية. في المقابل، snRNA تفتقر إلى موقع SM ظلت في السيتوبلازم بعد الحقن المجهري في هذه المقصورة في حين أن الحقن المجهري النووي من snRNA دون موقع SM يكشف أن تسلسل الربط SM مهم لتوطين الجسم Cajal لأن هذا snRNA يبقى في النواة ولكن لا تتراكم في الهيئات Cajal.
في بعض الأحيان ميكروجينكشن في مقصورة خلوية واحدة فقط فشل وخدع Dextran 70 كيلودالون يمكن العثور عليها في كل من النواة والسيتوبلازم. يتم تجاهل هذه الخلايا من تحليل إضافي. على الرغم من حقيقة أن يتم تخزين snRNAs المسمى الفلورسنت في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية قبل الحقن، يمكن أن يحدث تدهور الحمض النووي الريبي.
لا يتم نقل الرنا المتدهورة حقن في السيتوبلازم في النواة ويبقى موضعية في السيتوبلازم. وينبغي التخلص من هذا snRNA وينبغي توليف snRNA جديدة. من المهم ضبط الحقن بشكل صحيح والضغط التعويضي لنوع الخلية.
وكما قال من قبل، وضع الحد الأدنى الصحيح لحقن الخلية أمر ضروري للضجين المجهري جيدة. يرجى تذكر أن الفينول- الكلوروفورم المستخدمة أثناء عزل الحمض النووي الريبي أمر خطير وأن إبرة الحقن المجهري هي كائن حاد. كن حذرا عند التعامل مع هذه المواد.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في التكوُّن الحيوي للـ snRNAs الخاص بالسبليكوسوما ونقلها داخل الخلايا، باستخدام حقن دقيق لـ snRNAs المضيئة. يركز السؤال البيولوجي الرئيسي على توطين هذه snRNAs في الهياكل النووية المعروفة باسم أجسام كاحل، مما يوفر رؤى حول تسلسلاتها الأساسية للتوطين الصحيح.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- بيولوجيا جزيئية
- توطين الحمض النووي الريبي
الخلفية
- تلعب snRNAs أدوارًا حاسمة في الربط والتنقية الحمض النووي الريبي.
- يمكن أن يوضح فهم توطينها الآليات الخلوية المشاركة في وظيفة الحمض النووي الريبي.
- أجسام كاحل هي هياكل تحت نووية مرتبطة بتنقية snRNA.
- يُمكِّن الحقن الدقيق التلاعب المباشر وملاحظة جزيئات الحمض النووي الريبي داخل الخلايا الحية.
هدف الدراسة
- لدراسة آليات النقل والتوطين لـ snRNAs الخاص بالسبليكوسوما.
- لتقييم أهمية تسلسلات معينة من الحمض النووي الريبي في تحديد توطين snRNA.
- لتطوير طريقة موثوقة لتتبع جزيئات snRNA داخل الخلايا.
الطرق المستخدمة
- تم استخدام تقنية الحقن الدقيق باستخدام snRNAs المضيئة.
- استخدمت خلايا HeLa كنموذج بيولوجي لدراسة توطين snRNA.
- تم إجراء العديد من الضوابط والتعديلات أثناء عملية الحقن من أجل الدقة والموثوقية.
- تم تثبيت الخلايا وتعريضها للتوهج المناعي لتصوير علامات جسم كاحل.
- تم إجراء تقدير إشارات التوهج باستخدام ImageJ لتحليل مفصل.
النتائج الرئيسية
- تم توطين snRNA كامل الطول بنجاح في أجسام كاحل، مما يؤكد ضرورة موقع SM للتراكم الصحيح.
- أظهرت snRNA التي تفتقر إلى موقع SM توطينًا ناقصًا في أجسام كاحل، وبقيت في السيتوبلازم.
- أظهرت الحقن الضابطة أنماط حركة متوقعة، مما يساعد في التحقق من النتائج.
- كانت الحضانة والتعديل الدقيق لطريقة الحقن الدقيق أمرًا بالغ الأهمية لتحقيق نتائج ناجحة.
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة بروتوكولًا مفصلًا للتحقيق في نقل وتوطين snRNA في الخلايا الحية.
- يساعد فهم آليات توطين الحمض النووي الريبي في الكشف عن المسارات التنظيمية المحتملة المرتبطة بنشاط الحمض النووي الريبي.
- قد تسهم الرؤى المكتسبة من هذا البحث في دراسات بيولوجيا جزيئية أوسع نطاقًا تتعلق بوظيفة الحمض النووي الريبي والتنظيم الخلوي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Understanding spliceosomal snRNA localization into Cajal bodies provides mechanistic insight into RNA processing pathways relevant to target validation in nucleic acid therapeutics. The microinjection-based localization assay enables rapid interrogation of sequence determinants governing subcellular trafficking, supporting early-stage de-risking of RNA-targeted modalities. This approach contributes to predictive confidence in identifying functional RNA elements critical for therapeutic efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates RNA sequence elements that govern subcellular localization, enabling hypothesis testing of functional domains in snRNA.
- Operational Value: Facilitates rapid screening of mutant constructs to identify sequences essential for nuclear body accumulation.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking specific RNA motifs to validated subcellular localization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables quantitative assessment of RNA trafficking via fluorescence intensity ratios in defined subcellular compartments.
- Operational Value: Provides a reusable platform for testing RNA variants with standardized readouts for localization efficiency.
- Assay Readiness: Generates quantitative, imaging-based outputs suitable for hit confirmation in RNA-focused screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system compatibility by using human HeLa cells to model snRNA localization mechanisms.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by defining sequence-function relationships in RNA nuclear trafficking.
- Predictive De-risking: Reduces mechanistic ambiguity in RNA therapeutic design by validating localization-dependent functionality.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling sequence-function analysis prior to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA sequence determinants in subcellular localization and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative fluorescence readouts and reproducible localization metrics.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (Cajal body/nucleoplasm fluorescence ratios) enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use of human cell models and defined localization endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized capability for RNA localization testing applicable across multiple target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of RNA therapeutics by validating sequence-specific localization to functional nuclear compartments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility through controlled microinjection, fixation, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking RNA sequence features to validated subcellular trafficking, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA targets based on demonstrated localization competence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, fluorescence microscopy, and ImageJ-based quantification.
- Dependent on microfluidic injection systems, fluorescence microscopes with Z-sectioning capacity, and deconvolution software.
- Necessitates standardization of injection pressure, incubation time, and fixation protocols across users and cell lines.
- Requires adaptation considerations when extending to non-adherent or primary cell models.
- Practical limitations include RNA degradation risk and variable injection success, necessitating quality controls for labeled RNA integrity.
