الكشف عن طفيليات التربانوسوما خارج الأوعية الدموية عن طريق الشفط الإبرة الدقيقة

إن علم الخلايا الباهرة الباهرة هو تقنية غير مكلفة وبسيطة وسريعة وقليلة التوغل نستخدمها لجمع الطريوض من الآفات الملموسة في الأعضاء في الفئران الحية. وبالنظر إلى أن الطموح إبرة غرامة هو إجراء غير المحطة النهائية، فإنه يسمح لأخذ العينات المتكررة في نفس الحيوان مع مرور الوقت. إذا كان من الممكن ترجمة هذه النتائج إلى الماشية ، فإن هذه الطريقة ستكون مفيدة للغاية للأطباء البيطريين لتشخيص داء المثقبيات في الماشية في المزرعة.

إثبات عملية تشويه تلطيخ سيكون آنا مارغاريدا سانتوس، technologist مساعد من مختبري. للبدء، تأكد من التخدير باستخدام طريقة قرصة إصبع. عندما يكون رد الفعل من التراجع عن الساق غائبة، ضع الماوس في إعادة شغل الظهر.

جس الخصيتان بعناية لتحديد الحجم والمسافة من الجلد المطّل ثم يقيّدها بين السبابة والإصبع الأوسط أو بين السبابة والإبهام. لمزيد من شل الحركة الهدف، تمتد الجلد الإفراط بإحكام وتنظيف السطح مع مناديل الكحول. بعد ذلك، أدخل طرف إبرة إبرة قياس 23 متصلة بحقنة خمسة ملليلتر في الهدف مع التأكد من أن المكبس في حالة بقية.

لتطبيق شفط، تراجع المكبس حقنة إلى علامة ثلاثة إلى أربعة ملليمتر مرتين إلى ثلاث مرات. لزيادة احتمال الحصول على عينة تمثيلية واستهداف هياكل أصغر مثل epididymis ، إعادة توجيه الإبرة داخل الجهاز إما في خط مستقيم أو على طول عدة الظلال المختلفة. حرر الشفط ثم اسحب الإبرة.

لا يمكن إزالة الإبرة إلا بعد تحرير الضغط السلبي عن طريق ترك المكابس. خلاف ذلك، يحصل امتص التعرق في حقنة وغير قابل للاسترداد. تطبيق الضغط مع اسفنجة شاش معقمة في موقع ثقب للسيطرة على أي نزيف.

افصلي الحقنة عن الإبرة وملأها بالهواء. أعد توصيل الإبرة، ضع طرف الإبرة قريبًا جدًا من الشريحة أو حتى على الشريحة، واقذف محتويات الإبرة على الشريحة برفق. لضمان تكرار أخذ العينات، أداء طموح إضافي واحد على الأقل لكل جهاز والحيوان.

بعد الرجوع التخدير مع حقن تحت الجلد من 200 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل كيلوغرام Atipamezole في المالحة، والعودة الحيوانات إلى قفص وطنهم للتعافي. باستخدام اليد غير المثبطة، التقط الشريحة التي لديها قطرة الpirate معسر نهاية متجمد بين الإبهام وإصبع السبابة. باستخدام اليد المهيمنة، التقط شريحة منتشرة نظيفة ووضعها على نحو سلس حافة نظيفة عبر الشريحة الثانية فقط على الجزء العلوي من قطرة بزاوية 30 درجة تقريبا.

للحصول على فيلم رفيع، انزلق الشريحة إلى الأمام بحركة واحدة مستمرة وثابتة. بقية الشريحة والسماح لتجفيف الهواء الكامل والسريع من المواد. تسمية حافة متجمد من الشريحة مع قلم رصاص.

لبروتوكول تلطيخ Giemsa ، قم بإصلاح طخت الهواء المجففة عن طريق غمر الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على 100٪ من الميثانول لمدة خمس دقائق. ثم نقل الشرائح إلى جرة كوبلين التي تحتوي على 20٪ Giemsa الحل والمياه المقطر لمدة 30 دقيقة. شطف الشرائح في ماء الصنبور والداب مع ورقة الأنسجة لتجف جيدا.

أثناء الضغط على الشريحة أفقيًا ، ضع عدة قطرات من وسيط التركيب غير اللافت على اللطخة. ضع حافة غطاء الزجاج على الشريحة، وخفضه واضغط بلطف لإزالة أي فقاعات الهواء. بالنسبة للكيمياء المناعية، قم بإصلاح اللطاخات المجففة في الهواء بنسبة 100٪ من الميثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

غسل الشريحة لمدة خمس دقائق في جرة كوبلين مع 1X برنامج تلفزيوني تكرار هذه الخطوة ثلاث مرات باستخدام 1X PBS الطازجة في كل مرة. بعد إزالة الشرائح من جرة كوبلين، امسح العازلة الزائدة دون لمس اللطخة ورسم خط حول اللطخة مع قلم طارد للماء. أثناء الضغط على الشريحة أفقيًا، قم بتطبيق 150 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة لكل مسحة واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة، وغسل الشرائح لمدة خمس دقائق في جرة كوبلين مع 1X برنامج تلفزيوني تكرار هذه الخطوة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني 1X الطازجة في كل مرة. أثناء عقد الشريحة أفقيًا ، قم بتطبيق 150 ميكرولترات من الفجل الحصان المتاح تجاريًا peroxidase DAB على كل تشويه ثم احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح مرة أخرى ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني.

ثم وضع مضاد عن طريق غمر الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على هاريس هيماوكسيلين لمدة 10 ثوان. شطف قبالة في ماء الصنبور والداب مع ورقة لتجف جيدا. أثناء الضغط على الشريحة أفقيًا ، ضع عدة قطرات من وسيط التركيب غير اللافت على اللطخة.

ضع حافة غطاء الزجاج على الشريحة، وخفضه واضغط بلطف لإزالة أي فقاعات الهواء. وقد تميزت مسحة ذات نوعية جيدة من قبل أحادية من الخلايا ذات الكثافة الجيدة والحفاظ على الميزات المورفولوجية مما يسمح لتحديد الأنسجة الأصلية والنسبة النسبية بين بعضها البعض. وعلاوة على ذلك، فإن الطفيليات مُطَوَّدة بالمناعة، ويمكن تحديدها، ويمكن عدّها.

قد تكون نتائج التطلعات الإبرة الدقيقة السيئة أو السلبية بسبب القليل من المواد وبالتالي تحت تمثيل الكتلة أو الجهاز. ويمكن أيضا أن يكون بسبب الكثير من المواد على شريحة واحدة مما يجعل اللطاخات سميكة بشكل مفرط وإضعاف التقييم الخلوي. ما يسمى قطعة أثرية سحقت يحدث بسبب الكثير من القوة التي يتم تطبيقها عند جعل تشويه ترك إلى الخلايا المعطلة مما أدى إلى الكثير من النوى العارية والشرائط الحمض النووي.

عندما لا يتم تطبيق قوة كافية أثناء إعداد اللطاخة، لا تُفصَّل الخلايا مما يؤدي إلى طبقة طبقية تعوق تقييم السمات المورفولوجية للخلايا. مقارنة من غرامة إبرة التطلع علم الخلايا مع علم الأنسجة، وكان علم الخلايا ميزة أفضل الحفاظ على مورفولوجيا الخلوية وتقييم أفضل لنسب النسبية والعد من الخلايا. الكيمياء المناعية هي أبسط وأسرع وأسهل لتحسين من الكيمياء المناعية.

لطموح إبرة غرامة، وضمان دائما لشل جيدة من الحيوان، وتثبيت الأجهزة أو كتلة أن يستنشق، وتطبيق فراغ منسقة وإطلاق سراح. ثم لطاخات ذات جودة عالية، انتشرت على الفور بعد أن تم وضع المواد على الزجاج ويكون لطيف على قوة تطبيقها لجعل تشويه لتجنب القطع الأثرية سحقت الخلية. بالإضافة إلى المجهر الروتيني والكيمياء المناعية، يمكن أيضا استخدام هذه المواد للمجهر الإلكتروني، التحليل الكيميائي الحيوي، تدفق الخلايا، البيولوجيا الجزيئية، أو حتى في المختبرات.

سمحت لنا هذه التقنية بإثبات أن الطموح الإبرة الدقيقة يمكن استخدامها لتشخيص ودراسة الأمراض في الحيوانات التجريبية. تمكنا من تشخيص طفيليات المثقبيات للأعضاء التناسلية الذكورية الخارجية وكذلك توصيف هذا المرض على مدار العدوى.