Name: تنقية بروتين كتلة جزيئية عالية في موتان العقدية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: تعلم طريقة تنقية البروتينات عالية الكتلة الجزيئية في Streptococcus mutans باستخدام تقنية PCR والكروماتوغرافيا التوافقية. هذه الطريقة البسيطة تساعد الباحثين على دراسة وظائف الجينات في البكتيريا.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد دعمت هذا العمل الجمعية اليابانية لتعزيز العلم (رقم المنحة 16K15860 و19K10471 إلى T.M., 17K12032 to M.I., and 18K09926 to N.H.) ومؤسسة SECOM للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة 2018.09.10 No. 1).

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+3rd+Edition%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans%3A+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).</li>
<li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR%3A+The+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
</ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تصميم التمهيديات هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. تم تحديد تسلسل gtfC-عكس وSPCR-إلى الأمام التمهيديات تلقائيا على أساس تسلسل كل من منطقة نهاية 3′ من GTFC والمنطقة نهاية 5′ من sPCr. كل التمهيدي يتضمن 24 قواعد تكميلية التي ترميز رابط GS وتسلسل له العلامة الترميز في مناطقهم 5'. يمكن تجنب تعطيل التسلسلات التنظيمية الأصلية الموجودة في المناطق المحيطة بالمنبع بإضافة تسلسلات الترميز الخاص به إلى نهاية 3′. يجب إزالة codon وقف الحمض النووي من التمهيدي gtfCعكس...

وعادة ما ينطوي تحليل وظيفة الجين على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات البرية بالسلالات التي تعطل فيها جين الفائدة. وبمجرد إنتاج السلالة التي تعطلت الجينات، فإن الإضافة الخارجية للمنتج الجيني تسمح باستعادة وظيفية.
الطريقة الأكثر شيوعا للحصول على منتجات الجينات النقية اللازمة لتجارب الترميم اللاحقة هي عن طريق أداء التعبير غير المتجانس في الإشريكية القولونية1. ومع ذلك، فإن التعبير عن بروتينات الغشاء أو البروتينات الكتلية العالية غالبا ما يكون من الصعب استخدام هذا النظام1. في هذه الحالات، عادة ما يتم عزل البروتين المستهدف من الخلايا التي تجمع البروتين أصلا من خلال سلسلة معقدة من الخطوات، والتي قد تؤدي إلى فقدان المنتج الجيني. للتغلب على هذه القضايا، تم تطوير إجراء بسيط لتنقية المنتجات الجينية بعد طريقة تعطيل الجينات2،طريقة ربط الحمض النووي المستندة إلى PCR3 (المعينة ثنائي ونفي من خطوتين PCR)، والكهرباء للجينات التحول في موتات العقدية. إضافة علامة polyhistidine (له العلامة) إلى C-terminus من المنتج الجيني يسهل تنقية من قبل الكروماتوغرافيا المعدنية تقارب المعطلة (IMAC).
لعزل سلالة التعبير عن علاماته، يتم استبدال الحمض النووي الجينومي الكامل للجين موضع الاهتمام (في هذه السلالة التي تعبر عن الجينات التي تم التعبير عنها) بجين علامة مقاوم للمضادات الحيوية. إجراء لتوليد سلالة له العلامة التعبير عن متطابقة تقريبا لتلك التي لتوليد سلالة الجينات تعطل كما هو موضح سابقا4,5. ولذلك، ينبغي تنفيذ أساليب تعطيل الجينات وعزل المنتجات الجينية كتجارب متسلسلة للتحليل الوظيفي.
في العمل الحالي، يتم إرفاق تسلسل الترميز polyhistidine إلى نهاية 3′ من gtfC (GenBank locus tag SMU_1005) الجينات، ترميز غلوكوزيلترانسفيراز-SI (GTF-SI) في S. mutans6. ثم أجريت دراسات التعبير في الأنواع العقدية. تحقيق التعبير gt fC غير متجانسة من قبل E. القولونية من الصعب، على الأرجح بسبب الكتلة الجزيئية العالية من GTF-SI. هذه السلالة تدعى س. موتانس له-gtfC. رسم تخطيطي يصور تنظيم GTFC وspectinomycin كاسيت الجينات المقاومة(sPCr)7 loci في البرية من نوع S. mutans (S. mutans WT) وتظهر مشتقاته في الشكل 1 وGTF-SI هو بروتين إفرازي الذي يساهم في تطوير biofilm الأسنان المسببة للسرطان6. تحت وجود السكروز، لوحظ biofilm الملتصق على سطح زجاجي أملس في سلالة WT S. mutans ولكن ليس في سلالة S. mutans gtfC-disrupted(S. mutans ΔgtfC)2،5 . يتم استعادة تشكيل Biofilm في S. mutans ΔgtfC على إضافة خارجية من GTF-SI المؤتلف. سلالة، S. mutans له-gtfC، ثم يستخدم لإنتاج المؤتلف GTF-SI.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Nippon Genetics</td><td>NE-AG02</td><td>للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>نظام الثقافة اللاهوائية</td></tr> المضادة <tr><td>للجسم المضاد أحادي النسيلة</td><td>MBL</td><td>D291-7</td> HRP مجموعة فحص بروتين BCA <td>المترافق</td></tr><tr><td></td><td>HRP Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td> قياس <td>تركيز</td></tr> <tr><td>البروتينمرق ضخ قلب الدماغ</td><td>بيكتون ، ديكنسون</td><td>237500</td><td>وسط الثقافة البكتيرية</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>واكو</td><td>031-17922</td><td>لتلوين الأغشية الحيوية</td></tr><tr><td>وحدة الترشيح الفائق بالطرد المركزي</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>استبدال العازلة وتركيز البروتين</td></tr><tr><td>جهاز الطرد المركزي</td><td>Kubota</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>العمود الكروماتوجرافي</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>لمشبك غشاء غسيل الكلى</td></tr><tr><td></td><td>IMAC ماركة فيشر</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب غسيل الكلى</td><td>كواحد</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>بوليميراز الحمض النووي</td><td>تاكارا</td><td>R045A</td><td>تسلسل الحمض النووي بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة</td></tr><tr><td></td><td>Eurofins الجينوم ECL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الركيزة</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td>للنشاف الغربي</td></tr><tr><td>EDTA (0.5 م درجة الحموضة 8.0)</td><td>Wako</td><td>311-90075</td><td>تحضير العازلة Tris-EDTA</td></tr><tr><td>التثقيب الكهربائي كوفيت</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>فجوة 0.2 سم</td></tr><tr><td>المثقور الكهربائي</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>EtBr محلول</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>للرحلان الكهربائي لهلام</td></tr><tr><td>الاغاروز قاطع نطاق الجل</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Gel طقم الاستخراج</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>استخراج الحمض النووي من هلام الاغاروز</td></tr><tr><td>Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>29083461</td><td>ل SDS-PAGE والنشاف الغربي</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Wako</td><td>095-00015</td><td>المخزن المؤقت الملزم وإعداد المخزن المؤقت للشطف</td></tr><tr><td>حاضنة</td><td>Nippon Medical & الأدوات الكيميائية</td><td>EZ-022</td><td>إعداد درجة الحرارة: 4 درجة ؛ حاضنة C</td></tr><tr><td></td><td>Nippon Medical & الأدوات الكيميائية</td><td>LH-100-RDS</td><td>إعداد درجة الحرارة: 37 درجة ؛ </td></tr><tr><td>مرشح غشاء</td> C <td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0.2 & micro ؛ </td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي دقيق</td> القطر <td>m Kubota</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>تحضير المخزن المؤقت والشطف الملزمة</td></tr><tr><td>NaH2PO4& middot; 2H2O</td><td>واكو</td><td>192-02815</td><td>تحضير المخزن المؤقت للربط والشطف</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>تحضير المخزن المؤقت والشطف الملزم</td></tr> <tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>015-06737</td><td>ترسيب كبريتات الأمونيوم</td></tr><tr><td>راتنج النيكل المشحون</td><td>Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>بالنسبة إلى IMAC</td></tr><tr><td>بادئات PCR</td><td>Eurofins Genomics</td><td>بروتين</td> قياسي حسب الطلب <td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>ل SDS-PAGE وجهاز</td></tr><tr><td>ترشيح المذيبات</td> الغربي <td>كواحد</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>المضادات الحيوية ؛ استخدم في 100 و مو ؛ جم / مل</td></tr><tr><td>فلتر حقنة معقمة</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0.22 & micro ؛ م القطر</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &# 916; gtfC</td><td>سلالة الأسهم في المختبر.</td><td></td><td>gtfC ب spcr</td></tr><tr><td>Streptococus mutans UA159</td><td>سلالة مخزون في المختبر.</td><td></td><td>S. mutans ATCC 700610 ، سلالة من النوع البري</td></tr><tr><td>السكروز</td><td>واكو</td><td>196-00015</td><td>لتطوير الأغشية الحيوية</td></tr><tr><td>TAE (50 & مرة)</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>للرحلان الكهربائي لجل الاغاروز</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 م ، درجة الحموضة 8.0)</td><td>Wako</td><td>314-90065</td><td>تحضير العازلة Tris-EDTA</td></tr></tbody></table>

تنقية بروتين كتلة جزيئية عالية في موتان العقدية

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

وينطوي توضيح وظيفة الجين عادة على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات والسلالات البرية التي تعطل فيها جين الفائدة. يتم استعادة فقدان الوظيفة بعد انقطاع الجينات في وقت لاحق عن طريق إضافة خارجية للمنتج من الجين المعطلة. وهذا يساعد على تحديد وظيفة الجين. وتنطوي الطريقة التي سبق وصفها على توليد سلالة موتان العقدية التي تعطلت في الجينات gt. هنا، يتم وصف طريقة لا تتطلب لتنقية المنتج الجيني gtfC من سلالة S. mutans التي تم إنشاؤها حديثا بعد اضطراب الجينات. هو يتضمّن الإضافة من [بولهيستيدين-كدينغ] تسلسل في ال 3′ نهاية من المورثة الفائدة, أيّ يسمح تنقية بسيطة من المورّة منتوج يستعمل محصّلة معدنة تقارب كروماتوغرافيا. لا توجد ردود فعل أنزيمية غير PCR مطلوبة للتعديل الجيني في هذه الطريقة. واستعادة المنتج الجيني عن طريق إضافة خارجية بعد تعطيل الجينات هي طريقة فعالة لتحديد وظيفة الجينات، والتي يمكن أيضا تكييفها مع الأنواع المختلفة.

ويبين الشكل 3 حجم كل أمبير يكون من ثاني PCR(الشكل 3ألف)وPCR الثاني(الشكل 3B). ويتوافق حجم كل أمبير مع الحجم المتوقع، على النحو المبين في الجدول 1. ويبين الشكل 4A مستعمرات S. mutans التي تحولت مع المنتج PCR الثاني ومطلي على لوحات أجار BHI التي تحتوي على الأطياف. ثم تم تشغيل منتجات PCR مستعمرة على هلام أغاروز(الشكل 4B).</stron...

وصف هنا هو طريقة بسيطة لتنقية منتج الجينات في موتان العقدية. قد تكون هذه التقنية مفيدة في تنقية البروتينات، وخاصة بروتينات الغشاء والبروتينات الكتلية الجزيئية العالية، ويمكن استخدامها مع مختلف الأنواع البكتيرية الأخرى.

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة مثل، كيف ينقي منتج الجينات الذي يصعب التعبير عنه في E.Coli. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه لا يوجد تفاعل انزيمي ، بخلاف PCR ، هو الناقل ، ويمكن استخدام التطبيقات الشائعة لتنقية البروتين. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تنقية البروتين في المكورات العقدية المتطاوعة، فإنه يمكن أيضا أن يكون على علم الأنواع الميكروبية الأخرى.وسوف يكون إثبات الإجراء د.ماميكو ياماشيتا، طالب غراد من مختبرنا. بعد تصميم التمهيدي واستخراج الحمض النووي الجينومي من المكورات العقدية المتطاومة، تنفيذ PCR الأولى باستخدام المكورات العقدية البرية من النوع المتطاول وGFC تعطيل المكورات العقدية الطفرات الجينوم كقوالب PCR. تضخيم المناطق التي تؤوي الجزء المصب من جين gtfC وتلك التي تؤوي جين المقاومة spectinomycin باستخدام إعداد gtfC إلى الأمام واعكس التمهيدي وspc r إلى الأمام والمراحل العكسية.ثم، electrophorese كل منتج PCR على 1٪ agarose هلام. استخدام الهلام bandcutter لاستخراج شظايا الحمض النووي المطلوب من ما يقرب من 1،000 أزواج قاعدة و 2،000 أزواج قاعدة من هلام إلى أنابيب microcentrifuge. إضافة 500 ميكرولترات من العازلة solubilizing في كل أنبوب واحتضان لهم لمدة 10 دقيقة في 56 درجة مئوية لإذابة شرائح هلام.تنقية الشظايا باستخدام السيليكا الغشاء القائم على طريقة استخراج هلام. تنفيذ PCR الثاني باستخدام منتجات PCR الأول كقوالب PCR مع التمهيديات المتداخلة إلى الأمام وتكتل عكس. عندما لا يمكن تأكيد المنتج PCR الثاني بواسطة electrophoresis، يجب تصميم زوج التمهيدي متداخلة آخر.الكهرباء خمسة ميكروليترات من خليط PCR على هلام agarose. تأكيد توليد أمبيركون المناسبة من حوالي 3،000 أزواج قاعدة بواسطة ethidium بروميد هلام تلطيخ صورة والمضي قدما وفقا للمخطوطة. الآن، مزيج خمسة ميكرولترات من المنتج PCR الثاني المركزة إلى aloquot 50 ميكرولتر من الجليد الباردة، المختصة البرية من النوع العقديات الخلايا المتنية، المجمدة سابقا.يُضاف الخليط إلى الكوفيت الكهربائي ثم نضع الكوفيت في غرفة cuvette في جهاز الإلكتروبوريشن. إعطاء نبضة كهربائية واحدة من 1.8 كيلوفولت، 600 أوم، و 10 microfarads لمدة 2.5 مللي ثانية إلى الخلايا. إضافة 500 ميكرولترات من مرق ضخ الدماغ والقلب في cuvette.انتشرت على الفور 10 إلى 100 ميكرولترات من التعليق على الدماغ القلب ضخ لوحات أوبر التي تحتوي على سبكتينوميسين. احتضان لوحات لمدة يومين إلى ستة أيام في 37 درجة مئوية حتى المستعمرات نمت بما فيه الكفاية ليتم التقاطها. بعد جيل من المكورات العقدية المتطاولة تسلسل الترميز polyhistidine أدرجت سلالة والتلقح بين عشية وضحاها دون spectinomycin وفقا للمخطوطة، الطرد المركزي تعليق الثقافة البكتيرية لمدة 20 دقيقة في 10،000 مرات ز في أربع درجات مئوية.نقل الثقافة فائقة إلى كوب زجاجي ثلاثة لتر. لتركيز البروتينات من عظمى الثقافة، ضع السوبر لترين على مُحرك مغناطيسي وابدأ في التحريك القوي. إضافة 1، 122 غراما من كبريتات الأمونيوم والسماح للترسب لتشكيل مع اثارة قوية في أربع درجات مئوية على مدى فترة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها. التالي.أجهزة الطرد المركزي كبريتات الأمونيوم عجلت في 15، 000 مرات ز لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. اِنّهُ المُنَاَعِيّ. مع ملعقة، وجمع الترسب ونقله إلى كوب زجاجي 200 ملليلتر.resuspend الكريات في 35 ملليلتر من العازلة ملزمة. ثم, نقل كل ما يقرب من 25 ملليلتر من التعليق في أنابيب غسيل الكلى السليلوز مجددة. ضع أنابيب غسيل الكلى في 2.5 لتر من الحاجز الربط التحريك على مُحرك في أربع درجات مئوية لـ dialyze التعليق.استبدل محلول غسيل الكلى بعد ساعتين، وتواصل غسيل الكلى طوال الليل. نقل المقبل تعليق dialyzed من أنابيب إلى أنابيب الطرد المركزي ووضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي في 20،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. مع قسم الترشيح المعدات، صب سوبرنات على 0.2 ميكرومتر مرشح غشاء لتصفية.نقل الترشيح إلى قارورة 75 ملليلتر. لكسر gtfSI الموسومة ببولي هيستيدين من التعليق المرشّح، قم أولاً بإعداد كروماتوغرافيا معدنية غير ثابتة. بعد اكويفيرتينج الراتنج وفقا للمخطوطة، أغلق ديك قرصة هوفمان.إضافة خمسة ملليلتر من التعليق الذي تمت تصفيته في العمود لجعل الطين. ثم، نقل كل الطين إلى التعليق المتبقية المصفاة ودوامة الخليط بلطف لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. قم بتحميل الخليط مرة أخرى إلى العمود.فتح ديك قرصة هوفمان لإزالة تعليق من تدفق الجاذبية. غسل راتنج IMAC مع 20 ملليلتر من العازلة ملزمة ومن ثم، elute 20 ملليلتر من عازلة elution للحصول على gtfSI المؤتلف. بعد ذلك، تحميل eluate في أنبوب الترشيح فائقة الطرد المركزي والطرد المركزي الحل في 2، 000 مرات ز لمدة دقيقة إلى خمس دقائق لتركيز الحل.إفراغ حاوية الترشيح وإضافة 15 ملليلتر من المخزن المؤقت في أنبوب. الطرد المركزي العينة مرة أخرى، وتكرار العملية مرتين إضافية. وأخيراً يتركز الحل gtfSI المؤتلف إلى ما يقرب من ملليلتر واحد.نقل التركيز إلى أنبوب microcentrifuge وتخزينها في أربع درجات مئوية. متابعة مع بقية بروتوكول استعادة وظيفية. في هذا البروتوكول، يظهر الـ agarose gel electrophoresis أن حجم كل أمبيركون من PCR الأول والثاني PCR يتوافق مع الحجم المتوقع.تم تحويل مستعمرات المكورات العقدية مع المنتج PCR الثاني ومطلية على لوحات أوجر ضخ الدماغ والقلب التي تحتوي على سبتينوميسين. تظهر منتجات PCR مستعمرة تشغيل على هلام agarose أن كل أمبيركون كان من الحجم المتوقع. وقد لوحظ البروتين المنقى مع الكروماتوغرافيا تقارب المعادن غير المُشلَّم كقناة واحدة بواسطة SDS-PAGE.وأكدت البقعة الغربية، التي أجريت باستخدام الأجسام المضادة للبوليهيستادين، أن النطاق المرصود هو البروتين الموسوم بالبولي هيستيدين المتوقع البالغ 160 كيلودالطن. وقد شوهد فقط القدرة على تشكيل بيو فيلم مشتق من السكروز مع المكورات العقدية المتواطن البرية من النوع والcoccus العقدية الطفرات His-gtfC، والتي شكلت بيو فيلم مُلتمس على جدار الأنبوب في وجود 1٪sucrose. ولم يلاحظ ذلك في المكورات العقدية المتطاة دلتا gtfC.ومع ذلك ، فإن إضافة 25 ميكروغرام من gtfSI المؤتلف أعاد القدرة على تكوين بيو فيلم في العقديات المتوات دلتا gtfC. منذ نجاح هذه الطريقة يعتمد على تضخيم PCR الثاني، يجب تأكيد المنتج PCR الثاني بواسطة الكهرباء. بالفعل، البروتين من نوع الهستيدين التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة هو أيضا الدعوة إلى الأحماض الوظيفية، مثل البروتين البروتين التفاعلات.بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية ، بالاشتراك مع اضطراب الجينات ، الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف وظيفة الجينات.

purification-of-a-high-molecular-mass-protein-in-streptococcus-mutans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

ماما هي فريدة من نوعها Magnetosome البروتينات المرتبطة بها والتي كانت معروضة على المشاركة في تنشيط magnetosome. هنا نقدم بروتوكول تنقية ماما الحذف متحولة (MamAΔ41)...

تنقية م. magneticum سلالة AMB - 1 بروتين المرتبطين Magnetosome MamAΔ41

تنقية البروتينات من تقارب الموسومة بالاشتراك مع مطياف الكتلة (الألغام المضادة للأفراد) هو وسيلة قوية لرسم خرائط منهجية لشبكات التفاعل البروتين وعن التحقيق في أساس الآلية من العمليات البيولوجية. هنا، نحن تصف والأمثل متتابعة الببتيد تقارب الإجراء الألغام المضادة للأفراد (SPA) وضعت...

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

المصدر: Murata، T.، et al. تنقية بروتين عالي الكتلة الجزيئية في Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)يوضح هذا الفيديو إجراء خطوة بخطوة لتنقية بروتين يحمل علامة polyhistidine يفرز من Streptococcus mutans.

إجراء لتنقية بروتين الموسومة بالبولي هيستيدين من Streptococcus mutans

يوصف منهج الكيمياء الحيوية في الجسم الحي لتحديد البروتين البروتين التفاعلات (PPI) للبروتينات الغشاء. أسلوب يجمع بين البروتين عبر ربط، وتنقية تقارب ومطياف الكتلة، وقابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا أو الكائن الحي. مع هذا النهج، وحتى تحديد مثبطات مضخة البروتون عابرة يصبح ذلك ممكنا.

غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء في فيفو

ووصف طريقة لتنقية فعالة من البروتينات الانصهار المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات الخاصة على تعديل streptavidin (بكتيريا-Tactin) الراتنج تساهميا عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3). أسلوب لديها مزايا السرعة، وحسن الانتعاش البروتين الهدف ونقاء عالية، ومتوافق مع تحليل لاحقة من قبل مطياف الكتلة.

خطوة واحدة تنقية البروتينات التوأم بكتيريا الموسومة ومجمعات منها على بكتيريا-Tactin الراتنج عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية التحفيز تستجيب مع التطبيقات بدءا من تنقية البروتين المؤتلف لتسليم المخدرات. يصف هذا البروتوكول تنقية وتوصيف البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج بهم من القولونية باستخدام درجة حرارة المحلول المرحلة الانتقالية السلوك أقل الحرجة كبديل بسيطة لاللوني.

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

&lt; p class = 'jove_content'&gt;Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) هو متالوبوتياز مفرز وهدف دوائي واعد من العامل الممرض البشري المطثية العسيرة. نصف هنا جميع الطرق اللازمة لإنتاج وتحديد هيكل هذا البروتين.

إنتاج وبلورة وتحديد هيكل<em&gt; C. صعب</em&gt; PPEP-1 عن طريق Microseeding والزنك والصحراء

يصف هذا البروتوكول طريقه تنقيه لبروتين الكالسيوم الخالي من العلامات المؤتلف S100A12 والقلة المستحثة بالأيونات لاختبارات تحفيز البويضات البشرية.

تنقيه الS100A12 البشرية والأيونات الناجمة عنها لتحفيز الخلايا المناعية

تصف هذه المقالة منهجية للإفراط في التعبير عن Nsp15 المؤتلف ، وهو نوكلياز سام ، في نظام تعبير C41 (DE3) ، متبوعا بتنقية البروتين الموسوم باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد التقارب والحجم. يمكن تكييف هذه البروتوكولات مع البروتينات السامة الأخرى الصعبة.

الإفراط في التعبير عن النويات السامة وتنقيتها من الإشريكية القولونية

يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وقابلة للتكرار للاستخراج والترسيب، معتمدة على المذيب العضوي، لتنقية بولي الببتيد الشبيه بالإيلاستين (ELP) من الإشريكية القولونية، مما يوفر بديلا قابلا للتوسع المحتمل لطرق تنقية ELP التقليدية.

تنقية فعالة لببتيدات الإيلاستين الشبيهة بالإيلاستين (ELPs) من الإشريكية القولونية باستخدام طريقة الاستخلاص والترسيب المعتمدة على المذيب العضوي

تعلم طريقة تنقية البروتينات عالية الكتلة الجزيئية في Streptococcus mutans باستخدام تقنية PCR والكروماتوغرافيا التوافقية. هذه الطريقة البسيطة تساعد الباحثين على دراسة وظائف الجينات في البكتيريا.

تنقية بروتين كتلة جزيئية عالية في موتان العقدية

استكشف المزيد من الفيديوهات