توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد
June 30th, 2019
وصفنا بروتين كيناز جديد باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية: تحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة مخصصة محددة على خطوط الخلايا المختلفة والأنسجة، والتفاعلات من قبل التجارب coimmunoprecipitation، نشاط كيناز الكشف عن طريق الغربية وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة الفوسفاتية محددة وعن طريق γ [32P ] ATP وسم.
المناعة هو تقنية قوية جدا لعزل وتنقية البروتين المستهدف. في ظروف سلسة، قد تكون البروتينات أو المنظمين أو الركائز مُناعيًا مشتركًا. قد يتم اكتشاف شبكة تفاعل جديدة.
ويمكن أيضا تقييم نشاط البروتين المناعي. على وجه الخصوص، قد يتم اختبار نشاط كيناز على ركائز مختلفة بواسطة تسمية P32-ATP. ومع ذلك، يمكن تقييم نشاط مثبطات تستهدف كيناز المشاركة في مرض ما.
قد تشكل مركبات الرصاص لتطوير أدوية جديدة. ويمكن تمديد هذه الطريقة من الثدييات إلى الخميرة أو البكتيريا. هذه التقنية ليست بهذه الصعوبة.
إلى النقاط الرئيسية: تأكد من وجود تحكم سلبي للتأكد من أن التفاعل المكتشف محدد، واختر بعناية شروط التحلل للحفاظ على التفاعلات والنشاط. التفاصيل الصغيرة والإيماءات مهمة لضمان نجاح هذه التقنية ، ولا يتم وصفها أبدًا في المواد وأساليب المقالات. إثبات الإجراء سيكون فابيان غودين، وهو فني من مختبرنا.
بعد أن يتم إعداد الخلايا في غرفة زراعة الخلايا داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، واستخدام ماصة 10 ملليلتر لإزالة وسائل الإعلام من لوحات والتخلص منه في زجاجة نفايات مخصصة مع التبييض. ثم، إضافة 10 ملليلتر من DMEM جديدة مكملة، ووضع لوحات مرة أخرى إلى حاضنة في 37 درجة مئوية. لإعداد خليط transfection، في أنبوب 15 ملليلتر، إضافة 450 ميكرولترات من 10 ملليمتر تريس هيدروكلوريد حل في 7.5 pH، تستكمل مع EDTA ملليمولار واحد و 50 ميكرولترات من 2.5 مولار كلوريد الكالسيوم حل.
مزيج من قبل عكس. في الأنبوب، إضافة حجم المقابلة ل10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما، تضخيمها من قبل مجموعة midiprep الحمض النووي، وتم تخفيفها مع عازلة elution من هذه المجموعة، والتي تم تحديد تركيزها. عكس أنبوب لخلط.
ثم، مع التحريض على نحو سلس على خلاط دوامة، إضافة ببطء 500 ميكرولترات من BES المخزنة مركزة 2X المالحة، قطرة عن طريق قطرة في الأنبوب. تحريكه بعناية فائقة، وليس لتعكير تشكيل معقدة بين الحمض النووي والفوسفات الكالسيوم. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل، أو ما يصل إلى 45 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة.
الآن، نقل لوحة لنقل من الحاضنة إلى مجلس الوزراء السلامة. إضافة مجمعات الحمض النووي المعدة قطرة قطرة على الخلايا في جميع أنحاء سطح لوحة. احتضان لمدة 24 إلى 72 ساعة في الحاضنة في 37 درجة مئوية.
لمنع تدهور البروتين ، وإعداد عازلة التحلل على الجليد ، مع الأخذ في الاعتبار أربعة ملليلتر من عازلة تحلل لكل لوحة مصابة. خذ الصحن مع الخلايا المصابة من الحاضنة. إزالة وسائل الإعلام والتخلص منه في زجاجة نفايات التبييض مخصصة.
لغسل الخلايا، إضافة ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة على جانب لوحة قطرة قطرة، لتجنب فصل الخلايا المصابة. ودوامة بلطف لوحة لنشر العازلة في جميع أنحاء السطح. إمالة لوحة لإزالة برنامج تلفزيوني وتجاهله في زجاجة النفايات.
كرر الغسيل مرة أخرى. ضع الصحن على الثلج في النهاية، قم بإزالة بقية برنامج تلفزيوني بعناية.
بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولترات من عازلة التحلل البارد إلى الخلايا المغسولة. انشرها على سطح اللوحة احتضان لمدة 10 دقائق على الجليد.
من وقت لآخر، مرة أخرى انتشار العازلة في جميع أنحاء سطح لوحة. بعد ذلك ، استخدم ملعقة الخلايا لكشط الخلايا من السطح وجمعها في أنبوب microcentrifuge. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق في 10،000 مرة G وأربع درجات مئوية.
جمع lysate supernatant في أنبوب جديد microcentrifuge وجمع 50 ميكرولتر aliquot من هذا الكسر إلى آخر أنبوب microcentuge جديدة. سيتم استخدام هذا aliquot للتحقق مما إذا كانت البروتينات المصابة يتم التعبير عنها بشكل جيد. تخلص من البيليه في سلة المهملات.
أولا، resuspend بلطف حل الأسهم من الخرز agarose إلى جانب الأجسام المضادة المناسبة. قطع نهاية 200 طرف ميكروليتر لجعل فتحة ملليمتر واحد إلى اثنين. نعلق تلميح إلى micropipette ورسم ما يصل 40 ميكرولترات من الحل، مما يسمح الخرز لدخول طرف.
الميّزات الخرز صعودا وهبوطا عدة مرات لتشبع تلميح لضمان حجم الصحيح من الخرز ونقل الخرز إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة 500 ميكرولترات من TNET العازلة، مزيج من قبل عكس، والطرد المركزي لمدة دقيقتين في 1،000 مرات G وأربع درجات مئوية. إزالة بعناية فائقة، وإضافة 500 ميكرولترات من المخزن المؤقت TNET.
احتضان على عجلة دوارة لمدة ساعة واحدة على الأقل في أربع درجات مئوية. ثم، الطرد المركزي الأنبوب لمدة دقيقتين في 1،000 مرات G وأربع درجات مئوية وغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من عازلة التحلل عن طريق الانقكاس وrrifuging المركزية. بعد الغسيل، نقل الكسر الكلي الذي تم جمعه سابقًا في الأنبوب واحتضانه على عجلة دوارة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات.
الآن، الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المناعي لمدة دقيقتين في 1،000 مرات G و أربع درجات مئوية. غسل الخرز خمس مرات مع 500 ميكرولترات من العازلة تحلل عن طريق عكس وrrifuging. عند غسل الخرز، والحرص على عدم الذهاب قريبة جدا من الخرز في حين إزالة supernatant.
وإلا، سيتم ستنشق الخرز وفي نهاية التجربة، لن يترك المزيد من الخرز. ل elution، أول جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين في 1،000 مرة G وأربع درجات مئوية. استخدام ميكروبليت ملليلتر واحد لإزالة بعناية فائقة.
ثم، مع حقنة هاملتون مجهزة بإبرة أسمنت، إزالة آخر قطرات من فائق لتجنب الطموح من الخرز. المقبل، إضافة 40 ميكرولترات من 4X Laemmli العازلة. التجانس عن طريق النقر بلطف الأنبوب.
احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 10،000 مرة G ودرجة حرارة الغرفة. مع حقنة هاملتون، نقل مائل فائق إلى أنبوب جديد microcentrifuge.
تخزين في ناقص 80 درجة مئوية. وقد تم نقل خلايا HEK-293 مع LIMK 2-1 غير الموسومة أو واحدة من ايزوفورمات HA الموسومة من LIMK 2. LIMK 2-1 وأعرب عن ذلك بشكل جيد في الظروف المختلفة.
لا يتعرف الجسم المضاد LIMK 2-1 على LIMK 2a و LIMK 2b isoforms ، وهو محدد ، حيث تقل الإشارة عندما تكون الخلايا مصابة بـ LIMK2 صغير التداخل RNA ، مقارنة بالسيطرة على الحمض النووي الريبي الصغير التداخل. وفي مختلف خطوط الخلايا البشرية، بدا أن LIMK 2-1 يعبر عنها في هك-293 وهيلا، ولكن ليس في C6. واستخدمت تجارب الكويمونوبريسيتيشن لتقييم تفاعل LIMK2-1 مع الصخور النابعة. وقد تم التعبير عن كل من البروتينات المختلفة التي تم ترميزها بواسطة النواقل المُصابة بالعدوى بشكل جيد.
تم مناعة النماذج الثلاثة من LIMK2، وكذلك larp6، بكفاءة. في الاشفير، تم الكشف عن روك وبالتالي coimmunoprecipited مع isoforms الثلاثة من LIMK2، ولكن ليس مع larp6. ثم يكون التفاعل المكتشف محددًا.
تم اختبار LIMK 2-1 Coimmunocipitated لنشاطها كيناز عن طريق وضع العلامات اتيب P32 غاما. LIMK 2-1 لم phosphorylate cofilin، في حين أنها لم phosphorylate بروتين الميلين الأساسية، أو MBP. LIMK 2-1 هو بكفاءة المناعي في هذا الاختبار.
من المهم أن يكون لديك سيطرة سلبية أثناء إجراء عملية التنمّاع للتأكد من أن التفاعل محدد. يجب إعداد تكوين المخزن المؤقت للتحلل بعناية للحفاظ على التفاعل والنشاط. عند الاعتياد المناعي، قد يتم تقييم نشاط كيناز لحساب ركائز مختلفة.
ويمكن إدخال الطفرات بسهولة وقد تُكشف عن دور المخلفات المحددة. ويمكن أيضا إجراء دراسات وظيفية لفهم الدور الفسيولوجي للتفاعلات الجديدة البارزة. يجب أن تكون الخلايا مثقفة في غرفة ثقافة مخصصة داخل خزانة السلامة البيولوجية.
P32 ATP يجب التعامل معها بحذر محدد. درع للحماية من الإشعاع، عداد جيجر، جمع النفايات محددة، الثدي الشخصي وشارات الإصبع للكشف عن التعرض للإشعاع وتصفية النصائح.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه الدراسة بروتين كيناز جديد من خلال تقنيات كيميائية حيوية مختلفة. تشمل الطرق المستخدمة تحليل Western Blot، وتجارب الترسيب المناعي المشترك، وكشف نشاط الكيناز.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
- تفاعلات البروتينات
الخلفية
- تلعب الإنزيمات الكينازية أدواراً حاسمة في الإشارات الخلوية.
- فهم تفاعلات الكيناز يمكن أن يكشف عن أهداف علاجية جديدة.
- الترسيب المناعي المشترك هو طريقة رئيسية لدراسة تفاعلات البروتينات.
- الفسفرة هي آلية شائعة لنشاط الكيناز.
هدف الدراسة
- توصيف بروتين كيناز جديد.
- استكشاف تفاعلاته مع البروتينات الأخرى.
- تقييم نشاطه الكينازي على ركائز مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تحليل Western Blot باستخدام أجسام مضادة محددة.
- تجارب الترسيب المناعي المشترك.
- كشف نشاط الكيناز باستخدام أجسام مضادة محددة للفوسفات.
- تعرييم γ[32P] ATP لتقييم النشاط.
النتائج الرئيسية
- تحديد بروتين الكيناز وتعبيره في خطوط خلوية مختلفة.
- برهنة تفاعلات بروتينية محددة.
- تأكيد نشاط الكيناز من خلال فحوصات متعددة.
- رؤى حول الأدوار المحتملة في آليات المرض.
الاستنتاجات
- يظهر بروتين الكيناز الجديد تفاعلات هامة مع البروتينات الخلوية الأخرى.
- يمكن قياس نشاطه بشكل موثوق باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية المعمول بها.
- قد توضح الدراسات المستقبلية دوره في سياقات المرض.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Characterizing novel kinase proteins through robust biochemical methods enables early target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. This approach supports predictive confidence in pathway modulation and informs go/no-go decisions for therapeutic development. The integration of interaction mapping and activity assessment provides translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific protein interaction detection.
- Operational Value: Supports functional target validation by confirming kinase-substrate relationships.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by establishing mechanistic rationale for target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems suitable for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Provides sensitive and measurable kinase activity readouts via radioactive labeling.
- Reproducibility: Establishes standardized protocols for interaction and activity assessment across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects kinase function to cellular processes such as growth, division, and motility.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery through preclinical validation using consistent biochemical readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria based on target engagement and functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, enabling iterative validation of kinase function and modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via co-immunoprecipitation to clarify signaling networks and pathway context.
- Screening: Enables assay development with quantitative, substrate-flexible activity measurements for compound evaluation.
- Analytics: Generates measurable outputs such as phosphorylation levels and interaction specificity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects kinase activity to phenotypic outcomes in disease-relevant systems through functional substrate profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for kinase characterization applicable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking target engagement to functional kinase activity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lysis, immunoprecipitation, and washing conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by de-risking targets early through orthogonal validation of interaction and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on confirmed target modulation and pathway relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biochemistry, immunoprecipitation, and radioactive assay handling.
- Dependent on access to scintillation counters, radiation safety infrastructure, and specific antibody reagents.
- Necessitates cross-team standardization of lysis buffer composition and incubation conditions to preserve complexes.
- Involves adaptation considerations when extending from mammalian to non-mammalian model systems.
- Includes practical limitations such as radioactivity handling requirements and substrate availability for activity assays.
