توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

المناعة هو تقنية قوية جدا لعزل وتنقية البروتين المستهدف. في ظروف سلسة، قد تكون البروتينات أو المنظمين أو الركائز مُناعيًا مشتركًا. قد يتم اكتشاف شبكة تفاعل جديدة.

ويمكن أيضا تقييم نشاط البروتين المناعي. على وجه الخصوص، قد يتم اختبار نشاط كيناز على ركائز مختلفة بواسطة تسمية P32-ATP. ومع ذلك، يمكن تقييم نشاط مثبطات تستهدف كيناز المشاركة في مرض ما.

قد تشكل مركبات الرصاص لتطوير أدوية جديدة. ويمكن تمديد هذه الطريقة من الثدييات إلى الخميرة أو البكتيريا. هذه التقنية ليست بهذه الصعوبة.

إلى النقاط الرئيسية: تأكد من وجود تحكم سلبي للتأكد من أن التفاعل المكتشف محدد، واختر بعناية شروط التحلل للحفاظ على التفاعلات والنشاط. التفاصيل الصغيرة والإيماءات مهمة لضمان نجاح هذه التقنية ، ولا يتم وصفها أبدًا في المواد وأساليب المقالات. إثبات الإجراء سيكون فابيان غودين، وهو فني من مختبرنا.

بعد أن يتم إعداد الخلايا في غرفة زراعة الخلايا داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، واستخدام ماصة 10 ملليلتر لإزالة وسائل الإعلام من لوحات والتخلص منه في زجاجة نفايات مخصصة مع التبييض. ثم، إضافة 10 ملليلتر من DMEM جديدة مكملة، ووضع لوحات مرة أخرى إلى حاضنة في 37 درجة مئوية. لإعداد خليط transfection، في أنبوب 15 ملليلتر، إضافة 450 ميكرولترات من 10 ملليمتر تريس هيدروكلوريد حل في 7.5 pH، تستكمل مع EDTA ملليمولار واحد و 50 ميكرولترات من 2.5 مولار كلوريد الكالسيوم حل.

مزيج من قبل عكس. في الأنبوب، إضافة حجم المقابلة ل10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما، تضخيمها من قبل مجموعة midiprep الحمض النووي، وتم تخفيفها مع عازلة elution من هذه المجموعة، والتي تم تحديد تركيزها. عكس أنبوب لخلط.

ثم، مع التحريض على نحو سلس على خلاط دوامة، إضافة ببطء 500 ميكرولترات من BES المخزنة مركزة 2X المالحة، قطرة عن طريق قطرة في الأنبوب. تحريكه بعناية فائقة، وليس لتعكير تشكيل معقدة بين الحمض النووي والفوسفات الكالسيوم. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل، أو ما يصل إلى 45 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة.

الآن، نقل لوحة لنقل من الحاضنة إلى مجلس الوزراء السلامة. إضافة مجمعات الحمض النووي المعدة قطرة قطرة على الخلايا في جميع أنحاء سطح لوحة. احتضان لمدة 24 إلى 72 ساعة في الحاضنة في 37 درجة مئوية.

لمنع تدهور البروتين ، وإعداد عازلة التحلل على الجليد ، مع الأخذ في الاعتبار أربعة ملليلتر من عازلة تحلل لكل لوحة مصابة. خذ الصحن مع الخلايا المصابة من الحاضنة. إزالة وسائل الإعلام والتخلص منه في زجاجة نفايات التبييض مخصصة.

لغسل الخلايا، إضافة ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة على جانب لوحة قطرة قطرة، لتجنب فصل الخلايا المصابة. ودوامة بلطف لوحة لنشر العازلة في جميع أنحاء السطح. إمالة لوحة لإزالة برنامج تلفزيوني وتجاهله في زجاجة النفايات.

كرر الغسيل مرة أخرى. ضع الصحن على الثلج في النهاية، قم بإزالة بقية برنامج تلفزيوني بعناية.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولترات من عازلة التحلل البارد إلى الخلايا المغسولة. انشرها على سطح اللوحة احتضان لمدة 10 دقائق على الجليد.

من وقت لآخر، مرة أخرى انتشار العازلة في جميع أنحاء سطح لوحة. بعد ذلك ، استخدم ملعقة الخلايا لكشط الخلايا من السطح وجمعها في أنبوب microcentrifuge. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق في 10،000 مرة G وأربع درجات مئوية.

جمع lysate supernatant في أنبوب جديد microcentrifuge وجمع 50 ميكرولتر aliquot من هذا الكسر إلى آخر أنبوب microcentuge جديدة. سيتم استخدام هذا aliquot للتحقق مما إذا كانت البروتينات المصابة يتم التعبير عنها بشكل جيد. تخلص من البيليه في سلة المهملات.

أولا، resuspend بلطف حل الأسهم من الخرز agarose إلى جانب الأجسام المضادة المناسبة. قطع نهاية 200 طرف ميكروليتر لجعل فتحة ملليمتر واحد إلى اثنين. نعلق تلميح إلى micropipette ورسم ما يصل 40 ميكرولترات من الحل، مما يسمح الخرز لدخول طرف.

الميّزات الخرز صعودا وهبوطا عدة مرات لتشبع تلميح لضمان حجم الصحيح من الخرز ونقل الخرز إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة 500 ميكرولترات من TNET العازلة، مزيج من قبل عكس، والطرد المركزي لمدة دقيقتين في 1،000 مرات G وأربع درجات مئوية. إزالة بعناية فائقة، وإضافة 500 ميكرولترات من المخزن المؤقت TNET.

احتضان على عجلة دوارة لمدة ساعة واحدة على الأقل في أربع درجات مئوية. ثم، الطرد المركزي الأنبوب لمدة دقيقتين في 1،000 مرات G وأربع درجات مئوية وغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من عازلة التحلل عن طريق الانقكاس وrrifuging المركزية. بعد الغسيل، نقل الكسر الكلي الذي تم جمعه سابقًا في الأنبوب واحتضانه على عجلة دوارة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات.

الآن، الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المناعي لمدة دقيقتين في 1،000 مرات G و أربع درجات مئوية. غسل الخرز خمس مرات مع 500 ميكرولترات من العازلة تحلل عن طريق عكس وrrifuging. عند غسل الخرز، والحرص على عدم الذهاب قريبة جدا من الخرز في حين إزالة supernatant.

وإلا، سيتم ستنشق الخرز وفي نهاية التجربة، لن يترك المزيد من الخرز. ل elution، أول جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين في 1،000 مرة G وأربع درجات مئوية. استخدام ميكروبليت ملليلتر واحد لإزالة بعناية فائقة.

ثم، مع حقنة هاملتون مجهزة بإبرة أسمنت، إزالة آخر قطرات من فائق لتجنب الطموح من الخرز. المقبل، إضافة 40 ميكرولترات من 4X Laemmli العازلة. التجانس عن طريق النقر بلطف الأنبوب.

احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 10،000 مرة G ودرجة حرارة الغرفة. مع حقنة هاملتون، نقل مائل فائق إلى أنبوب جديد microcentrifuge.

تخزين في ناقص 80 درجة مئوية. وقد تم نقل خلايا HEK-293 مع LIMK 2-1 غير الموسومة أو واحدة من ايزوفورمات HA الموسومة من LIMK 2. LIMK 2-1 وأعرب عن ذلك بشكل جيد في الظروف المختلفة.

لا يتعرف الجسم المضاد LIMK 2-1 على LIMK 2a و LIMK 2b isoforms ، وهو محدد ، حيث تقل الإشارة عندما تكون الخلايا مصابة بـ LIMK2 صغير التداخل RNA ، مقارنة بالسيطرة على الحمض النووي الريبي الصغير التداخل. وفي مختلف خطوط الخلايا البشرية، بدا أن LIMK 2-1 يعبر عنها في هك-293 وهيلا، ولكن ليس في C6. واستخدمت تجارب الكويمونوبريسيتيشن لتقييم تفاعل LIMK2-1 مع الصخور النابعة. وقد تم التعبير عن كل من البروتينات المختلفة التي تم ترميزها بواسطة النواقل المُصابة بالعدوى بشكل جيد.

تم مناعة النماذج الثلاثة من LIMK2، وكذلك larp6، بكفاءة. في الاشفير، تم الكشف عن روك وبالتالي coimmunoprecipited مع isoforms الثلاثة من LIMK2، ولكن ليس مع larp6. ثم يكون التفاعل المكتشف محددًا.

تم اختبار LIMK 2-1 Coimmunocipitated لنشاطها كيناز عن طريق وضع العلامات اتيب P32 غاما. LIMK 2-1 لم phosphorylate cofilin، في حين أنها لم phosphorylate بروتين الميلين الأساسية، أو MBP. LIMK 2-1 هو بكفاءة المناعي في هذا الاختبار.

من المهم أن يكون لديك سيطرة سلبية أثناء إجراء عملية التنمّاع للتأكد من أن التفاعل محدد. يجب إعداد تكوين المخزن المؤقت للتحلل بعناية للحفاظ على التفاعل والنشاط. عند الاعتياد المناعي، قد يتم تقييم نشاط كيناز لحساب ركائز مختلفة.

ويمكن إدخال الطفرات بسهولة وقد تُكشف عن دور المخلفات المحددة. ويمكن أيضا إجراء دراسات وظيفية لفهم الدور الفسيولوجي للتفاعلات الجديدة البارزة. يجب أن تكون الخلايا مثقفة في غرفة ثقافة مخصصة داخل خزانة السلامة البيولوجية.

P32 ATP يجب التعامل معها بحذر محدد. درع للحماية من الإشعاع، عداد جيجر، جمع النفايات محددة، الثدي الشخصي وشارات الإصبع للكشف عن التعرض للإشعاع وتصفية النصائح.