عزل الخلايا أحادية اللامينا بروبريا أحادية النونافة من القولون المورين باستخدام Collagenase E

وقد ثبت أن العزلة في تحليل فينوتوبيك للخلايا المناعية من الأمعاء باستخدام هذا البروتوكول تنطبق على فهم الاضطرابات الالتهابية الجهازية والجالية. يعزل هذا الأسلوب عددا كبيرا من الخلايا أحادية النوى قابلة للحياة عن طريق التقليل من تلوث الحطام مما يسمح في وقت لاحق الظاهري المناعي من قبل Atomistry فلور أو أساليب أخرى. كما الأمعاء هو موقع الهدف الرئيسي للالتهاب في العديد من الأمراض، وهذا البروتوكول قد تكون مفيدة لدراسة السكان المناعي المعوي في نماذج الماوس من السرطان, الحساسية, زرع, و autoimmunity.

ولتحسين العائد والكفاءة في هذا البروتوكول، يوصى بإعداد الحلول والمواد الرئيسية مسبقاً كما هو مذكور. بعد القتل الرحيم الماوس وجعل شق خط الوسط الرأسي، واستخدام مقص تشريح غرامة لفتح الصفاق. باستخدام ملقط، نقل الأمعاء الدقيقة إلى جانب واحد وفضح القولون التنازلي.

اسحب لأعلى قليلاً على القولون التنازلي لفضح الجزء المستقيمي من القولون إلى أقصى حد. ثم، قطع المستقيم القاصي في عمق الحوض وتشريح القولون بأكمله كوحدة واحدة من المستقيم القاصي إلى قبعة ال cecal. أولاً، ضع القولون على منشفة ورقية مبللة واستخدم الطرف الحاد لزوج من المقص أو ملقط لتطبيق ضغط خفيف على جدار الأمعاء واستخراج البراز الصلب.

بعد ذلك، ضع القولون في طبق بتري واستخدم حقنة 10 ملليلتر مع إبرة مملوءة حادة عيار 18 لطرد الأمعاء مع 10 ملليلتر من مخزن القولون المبرد. ضع القولون في طبق بتري مملوء بـ 5-10 ملليلتر من مخزن القولون المبرد وينهيج يدويًا لغسل محتويات القولون المتبقية. كرر هذا الغسيل 2-3 مرات، وذلك باستخدام طبق بتري جديد يحتوي على عازلة جديدة لكل غسل.

بعد ذلك، نقل القولون إلى طبق بتري جديد يحتوي على العازلة القولون المبردة الطازجة. قطع القولون طوليا من نهاية المستقيم أكثر العضلات إلى القولون القريب، لتوليد قطعة القولون مفتوحة مستطيلة واحدة. تجاهل الوسيط في الطبق واستبداله بمخزن القولون المبرد النظيف.

وضع نسيج القولون مستطيلة على منشفة ورقية التي يتم ترطيبها مع العازلة القولون وقطع عليه عن طريق تشريح أفقيا ومن ثم إلى شظايا صغيرة. استخدام الملقط غرامة لجمع شظايا القولون في أنبوب مخروطي بولي بروبلين 50 ملليلتر تحتوي على 20 ملليلتر من العازلة القولون المبردة. ثم، غسل الشظايا عن طريق دوامة بقوة الأنبوب لمدة 30 ثانية.

بعد غسل, السماح لشظايا الأنسجة تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب قبل decanting أو فراغ التعرق, التأكد من تجنب فقدان شظايا الأنسجة, كرر هذه العملية غسل كامل 3 مرات باستخدام العازلة القولون الطازجة لكل غسل. للبدء، إضافة 20 ملليلتر من الكولاجين الهضم العازلة إلى أنبوب يحتوي على شظايا القولون غسلها. ختم الأنبوب ووضعها في شاكر المدارية في 37 درجة مئوية مع معدل دوران 2 مرات G لمدة 60 دقيقة.

تأكد من أن شظايا الأنسجة في حركة مستمرة أثناء التحريض. أولا، صب 5 ملليلتر من 66٪ السيليكا على أساس وسائل الإعلام الفصل كثافة في كل من 3 أنابيب البولي بروبلين 15 ملليلتر منفصلة. بعد ذلك ، استخدم ماصات مصلية 25 ملليلتر لجمع فقط المابس من كولاجيناز هضم 1.

تصفية supernatant من خلال 40 ميكرولتر الفقراء مرشح النسيج النسيج مصفاة وضعت في أنبوب مخروطية البولي بروبلين 50 ملليلتر نظيفة. ملء أنبوب تماما مع المبردة العازلة القولون لإخماد الكولاجين الهضم العازلة. ثم تدور الخلايا، وتتعرق وندفع، والحفاظ على بيليه على الجليد.

مواصلة تنفيذ كولاجيناز الهضم 2 كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد اكتمال هضم كولاجيناز 2، طرد شظايا الأنسجة بقوة ذهابا وإيابا بين الأنبوب وحقنة 10 ملليلتر من خلال إبرة نهاية حادة قياس 18. كرر هذا التدفق لمدة 7-8 مقاطع على الأقل، وتستمر حتى لا تظهر أي شظايا الأنسجة الإجمالية أو الحطام.

المقبل, تمرير تعليق تقسيم الأنسجة من خلال 40 ميكرومتر الفقراء مصفاة خلية الترشيح النسيج وضعت في أنبوب البولي بروبلين 50 ملليلتر نظيفة. ملء أنبوب إلى حافة مع العازلة القولون المبردة لإخماد الهضم والطرد المركزي في 800 مرة G في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل supernatant عبر فراغ الطموح وسحب بيليه علقت من كولاجيناز الهضم 1 إلى أنبوب المقابلة لها.

بعد هذا, إعادة تعليق كل بيليه في 24 ملليلتر من 44٪ السيليكا أساس كثافة فصل وسائل الإعلام لكل القولون. استخدام ماصة المصلية ملليلتر 10 ملليلتر لطبقة ببطء 8 ملليلتر من هذه الوسائط على كل من 3 أنابيب تحتوي على 66٪ سيليكا أساس كثافة وسائل الإعلام. توازن الأنابيب بعناية داخل دلاء أجهزة الطرد المركزي باستخدام مقياس الوزن أو التوازن.

جهاز طرد مركزي في 859 مرات G في 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة دون كسر. السماح للقضبان تأتي لاستكمال الراحة قبل إزالة الأنابيب، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا في واجهة التدرج. أولاً، تصور واجهة التدرج بالقرب من علامة 5 ملليلتر، حيث عادةً ما يكون هناك شريط أبيض سميك يبلغ 1-2 ملليلتر.

فراغ التعرق وتجاهل أعلى 7 ملليلترات من التدرج للسماح أسهل وصول ماصة إلى واجهة. باستخدام شفط مستمر اليدوي وثبات حركة المعصم الدورية، وجمع طبقة واجهة من الخلايا. جمع حتى واجهة بين التدرجين واضح والانكسار ونقل واجهة إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر البولي بروبلين المخروطية.

بعد ذلك، إضافة FACS العازلة لهذا الحوض حتى يصل إجمالي تعليق 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 800 مرة G في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ثم, الطامح عن طريق التطلع فراغ وإعادة تعليق بيليه في 1 ملليلتر من FACS العازلة.

يمكن استخدام الإجراء الموصوف في هذا الفيديو لعزل الخلايا أحادية النوى عن القولون أو، مع تعديلات، من الأمعاء الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء تحليل الخلايا والبيانات لمقارنة الكسور من الخلايا الليمفاوية المبرمجة والنخرية / الميتة عند استخدام إما Collagenase E أو D لعزل، مع دينا دون DNAse 1 العلاج. بعد Annexin 5 وقابلة للإصلاح حية حية صبغة زرقاء ميتة تلطيخ على تعليق خلية واحدة بعد كل عزلة، أظهر Collagenase E دون DNAse نسبة أعلى بكثير من الخلايا الحية بعد العزلة بالمقارنة مع كولاجيناز D دون DNAse.

حتى بالمقارنة مع أي collagenase مع DNAse. بالإضافة إلى ذلك، حددنا الخلايا النخرية بنسبة متوسطة تبلغ 41.0٪ في مجموعة Collagenase E مقابل 90.0٪ في مجموعة Collagenase D. 75.9٪ في مجموعة كولاجيناز E DNAse و 80.3٪ في مجموعة كولاجيناز D D.

ثم يتم تطبيق قياس تدفق متعدد perimetric إلى MNC معزولة عن CD45.2 صمام- C الفئران المتلقي في اليوم 7 بعد تلقي BMT أو إما نماذج BMT الالجينية أو سينجينيك. يتم حساب متوسط الأرقام المطلقة لـ "المانحة CD4" الإيجابية وC8 الخلايا T-positive المستخرجة من القولون المتلقي BMT ومقارنتها. لذلك يمكن أن يكون من المهم تحديد و / أو كميات مجموعات الخلايا المناعية النادرة في نماذج الماوس هذه.

يتم تقييم المجموعات الفرعية النادرة، بما في ذلك الخلايا التنظيمية T الإيجابية المشتقة من FOX-P3 المشتقة من الجهات المانحة في كل من نماذج BMT السينية واللوجينية. باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحليل حتى مجموعات فرعية نادرة، مثل المانحة مشتقة القولون T التنظيمية تسلل القولون الماوس المتلقي، بعد BMT. وتجدر الإشارة إلى أن كولاجيناز E نشط عند 37 درجة مئوية.

لذلك ينبغي أن تكون جميع حلول الكولاجين ساخنة مسبقاً لنشاط الكولاجين الكافي وإخمادها بدقة لإنهاء النشاط. يسمح هذا البروتوكول لعدد كبير من الخلايا أحادية النوى التي يمكن استخدامها للتوصيف اللاحق من قبل Fleur cytometry ، وتقنيات البيولوجيا الجزيئية ، والمجهر ، والثقافة ، وموقع ، من بين أمور أخرى. قدم هذا البروتوكول تقييمًا يمكن الاعتماد عليه للالتهاب في القولون من الفئران التجريبية مقابل التي تسيطر عليها في نموذج زرع نخاع العظم.

وبالتالي تسهيل اكتشاف آليات جديدة مناعية تنظيمية للتسامح زرع. Collagenase من Clostridium Istoliticum هو كاشف التي ينبغي التعامل معها مع تقنيات السلامة المختبر. وهو يشكل خطرا على الصحة عند استنشاقه وقد يسبب تهيج الجلد والعين.