البطانة الظهارة الظهارية الظهارة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة محددة خالية من التغذية وXeno

نحن نقدم إنتاج خلايا الدم من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نحصل على غلة متسقة ودقيقة من الخلايا البطانية الهادوجينية. نتوقع أن منصة لدينا سوف تمكن تطبيقات واسعة في رصد الأمراض وفحص المركبات العلاجية.

هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لأمراض الدم وأبحاث المناعة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على التدخل الوراثي أو تحرير الجينات من خلايا الدم البشرية. وهو يسمح لسهولة الحث على ناقلات في الخلايا البطانية الهيموجينية.

النقطة الأكثر أهمية هي طلاء LM511-E8 لكتابة مستعمرات PSC. لا نوصي بتخطي الطلاء أو استبداله بمصفوفة أخرى. المظاهرات البصرية مهم لأننا نريد أن نظهر كيفية شطف الخلايا مع العازلة الانفصام وكيفية معطف لوحات مع LM511-E8.

تنمو الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أو hPSCs إلى ما بين 70 و 80٪ التقاء على لوحة LM511-E8 المغلفة ستة جيدا في المتوسط mTeSR1. أربعة أيام قبل الحث الهيموجينيك، يتبخر المتوسطة ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. شطف الخلايا مع محلول الانفصام، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

Resuspend الخلايا في PSC متوسطة الصيانة ونقل التعليق إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق. استلهمت من فوق، و resuspend الخلايا في PSC طلاء المتوسطة.

لوحة تعليق PSC وفقا لتوجيهات المخطوطة على وعاء بلاستيكي microfabricated، واحتضان بين عشية وضحاها. قبل ثلاثة أيام من الحث الهيموجينيك، ماص بلطف اللولبيات PSC في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وتركها لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة للترسب بالجاذبية. pirate ابر ونسفة spheroids في الواسطة تصفيح spheroid.

توزيع التعليق في LM511-E8 المغلفة 10 سنتيمتر طبق الثقافة في كثافة أربعة spheroids لكل سنتيمتر مربع واحتضان لمدة ثلاثة أيام. بعد ثلاثة أيام، التعرق المتوسطة، إضافة يوم صفر التمايز المتوسطة، وثقافة الخلايا لمدة يومين في حاضنة نقص الأكسجة. ثم، الطامح اليوم صفر المتوسطة، إضافة اليوم الثاني تمايز المتوسطة، والثقافة لمدة يومين آخرين.

بعد يومين، التعرق المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. شطف الخلايا مع محلول الانفصام واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، افصل الخلايا عن طريق إعادة تعليقها بلطف في EDTA واحد ميليمولار.

نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، والطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق. التعرق وssuspend بيليه الخلية مع 300 ميكرولترات من العازلة الفاصل المغناطيسي. أضف 100 ميكرولترات من الميكروبات إيجابية CD34 إلى الخلايا، ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب.

احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم استخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر للضغط على التعليق وفصل الخلايا إيجابية CD34 باستخدام فاصل مغناطيسي. الاستغناء 0.5 ملليلتر من 5 ميكروغرام لكل ملليمتر في المليلتر حل طلاء في كل بئر من 24 لوحة ثقافة جيدا، واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، الطرد المركزي فرز CD34-إيجابية الخلايا في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من متوسط EHT.

تحديد كثافة الخلية القابلة للتطبيق باستخدام عداد الخلية، وضبط كثافة الخلية إلى 200000 خلية لكل ملليلتر عن طريق إضافة متوسط EHT. التعرق والتخلص من حل طلاء من الآبار المغلفة فيبرومينكتين، والاستغناء 0.5 ملليلتر من تعليق الخلايا CD34 إيجابية في كل بئر. احتضان الخلايا في حاضنة نقص الأكسجة لمدة أسبوع واحد.

لجمع الخلايا العائمة، نقل متوسط الثقافة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق. ثم تعرق المُندفع. لجمع الخلايا الملتصية ، وغسلها مرتين مع 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ، وشطف لهم مع عازلة فصل.

التعرق السائل الفائض واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من عازلة Facs، وخلط الخلايا العائمة وأتباع. الطرد المركزي الخلايا المختلطة في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق، ثم pirate فائقة وإعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولترات من عازلة الفاكس.

تمييع الأجسام المضادة لـ CD34 وCD45 المضادة في 50 ميكرولترات من عازلة Facs؛ أضفها إلى الخلايا واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق بعد كل غسل. استلهمت الخلايا المتفوّقة و resuspend في 0.5 ملليلتر من عازلة الفاكس مع 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر dappy.

قياس التعبير CD34 وD45 حسب تدفق القياسات. لجمع الخلايا الدموية، نقل المتوسطة الثقافة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. جمع الخلايا المتبقية عن طريق الشطف بلطف البئر مرتين مع برنامج تلفزيوني.

الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق ثم الpirate ة فائقة و resuspend في ملليلتر واحد من متوسطة EHT. بعد عد الخلايا، إضافة 10،000 الخلايا إلى ثلاثة ملليلتر من وسائط الميثيلcellulose متباعدة، وتستكمل مع المضادات الحيوية، واستخدام حقنة قياس 16 لخلط خمس مرات. الاستغناء عن تعليق وسائل الإعلام بأكملها في كل بئر من لوحة ستة جيدا.

للحفاظ على الخلايا رطبة، إضافة الماء أو برنامج تلفزيوني إلى الآبار الفارغة على لوحة. احتضان الخلايا لمدة أسبوعين ، مع التأكد من عدم إزعاج الطبق لأن المستعمرات حساسة للحركة. بعد أسبوعين، عد المستعمرات تحت المجهر.

تغيير الخلية شكليا من endothelial إلى الخلايا الدموية على التحفيز مع كوكتيل الدم. ظهور مستعمرات الخلايا ال دموي في الثقافة. الخلايا السلفة الدموية التعبير CD34 و CD45، لذلك يتم استخدام عملية استئصال الخلايا تدفق لتأكيد وجود مستعمرات الخلايا مكون الدم من خلال تحليل التعبير من CD34 و CD45.

وأظهرت مستعمرة تشكيل وحدة فحص جيل الحبيبات أو مستعمرات الضامة من خلايا الكبرية CD34 إيجابية وD45 إيجابية. ويقدر عدد المستعمرة إلى 38 مستعمرة تشكيل وحدات لكل 10،000 خلية. الخطوات الأكثر أهمية هي فرز spheroids PSC.

وجدنا أن متري السطح هو العامل الأكثر حتمية في كفاءة هذا البروتوكول. ويمكن أن يتبع هذا الإجراء من قبل خارج الجاهزة لإنتاج الخلايا الحساسية مثل الخلايا التي تحدث بشكل طبيعي و الضامة. تتيح هذه المنصة للباحثين استكشاف العوامل القطعية الرئيسية في تطور الدم البشري.