في فيسيكولو التوليف من السلائف غشاء الببتيد لنمو الحويصلة المستقلة

تقدم هنا بروتوكولات لإنشاء الحويصلات أحادية اللاميلار الصغيرة القائمة على الببتيد قادرة على النمو. لتسهيل في إنتاج vesiculo من الببتيد الغشاء، وقد تم تجهيز هذه الحويصلات مع نظام ترجمة النسخ وبلازميد الببتيد ترميز.

في بروتوكول لدينا، ونحن نستخدم إعادة ترطيب الفيلم من الخرز الزجاجي الصغيرة لتشكيل أجزاء رد فعل مصنوعة من الببتيدات. في التجارب، نستفيد من بساطة البروتوكول ومدى صموده. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على دمج حتى عينات حساسة، مثل استخراج الخلايا الخام المستخدمة.

سوف الاتصال مع المذيبات العضوية تؤثر بشكل كبير على العينة. لبدء هذا الإجراء، استخدم مكثف فراغ الطرد المركزي لتركيز حل ELP إلى 1.1 ملليمولار. مزيج 200 ميكرولترات من هذا الحل المركز مع 1، 250 ميكرولترات من اثنين إلى واحد من كلوروفورم والميثانول خليط.

دوامة الحل لخلط شامل. بعد ذلك، أضف 1.5 جرام من الخرز الزجاجي الكروي إلى قارورة قاعية مستديرة لمدة عشرة ملليلتر. إضافة ELP والميثانول الكلوروفورم حل إلى قارورة أسفل الجولة، ويهز بلطف لخلط.

قم بتوصيل القارورة بمبخر دوار. ضبط السرعة إلى 150 دورة في الدقيقة وتنظيم الضغط إلى 20،000 باسكال لمدة أربع دقائق تقريبا، حتى يتبخر السائل في درجة حرارة الغرفة. من المهم أن نكون حذرين عند استخدام المبخر الدوار بسبب التخلف الغليان المحتمل.

بعد هذا، التفاف فضفاضة رقائق الألومنيوم حول فتح قارورة أسفل مستديرة لمنع فقدان الخرز الزجاجي ووضع القارورة في مجفف لمدة ساعة واحدة على الأقل، لضمان أن يتم تبخر الكلوروفورم والميثانول المتبقية. لتجربة واحدة، مزيج 100 ملليغرام من الخرز الزجاجي الببتيد غطت مع 60 ميكرولترات من محلول تورم. احتضان هذه العينة في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

استخدام الطاردة المركزية الجدول الأعلى للطرد المركزي العينات بسرعة ورواسب الخرز الزجاجي. ثم استخدام ماصة لجمع نابيرانت، الذي يحتوي على الفحوى. أولا، مزيج 100 ميكرولترات من الحمض النووي البلازميد قبل تنقية مع 100 ميكرولترات إما روتي الفينول، الكلوروفورم، أو الكحول الأيزوميل في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير لتمكين فصل المرحلة أفضل.

عكس بلطف أنبوب يصل إلى ست مرات والطرد المركزي في 16،000 مرات ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى المرحلة العليا، وعكس أنبوب تصل إلى ست مرات. الطرد المركزي العينة في 16، 000 مرة ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد هذا، الماصات المابس إلى أنبوب منفصل وإضافة 10 ميكرولترات من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس لهطول الأمطار الإيثانول. أضف ملليلتر واحد من الإيثانول البارد عند 80 درجة مئوية ويخزن العينة عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، الطرد المركزي العينة في 16،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

decant المابير وإضافة ملليلتر واحد من الايثانول الباردة 70٪ في 20 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي في 16،000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، وإزالة السائل عن طريق الأنابيب، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الحمض النووي.

تخزين العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة تقريبا لتتبخر الإيثانول المتبقية. بعد ذلك، إضافة المياه النقية جدا إلى العينة لضبط تركيز العينة إلى ما يقرب من 300 نانومولار، والذي يقاس من خلال امتصاص في 260 نانومتر. لإعداد رد فعل ترجمة النسخ، اتبع استخراج الخلية الخام المعدة و المخزن المؤقت للتفاعل على الجليد.

لمزيج تفاعل 60 ميكرولتر، إضافة الحمض النووي البلازما إلى 37.5 ميكرولترات من العازلة رد فعل، إضافة 28.7 ميكرولترات من استخراج الخلايا الخام وملء مع المياه النقية جدا إلى حجم النهائي من 58.8 ميكرولترات. الحق قبل أن يبدأ التفاعل، إضافة 1.2 ميكرولترات من حل البوليميراز T7RNA، وماصة صعودا وهبوطا لخلط. احتضان العينة ومحلول تورم عند 29 درجة مئوية طوال مدة التجربة ، والتي عادة ما تكون من أربع إلى ثماني ساعات.

تظهر صور التصوير المجهري للإلكترونات من الـ"إنسيلت" (مجهرية) من الـ"إنسيل" أن حلول التورم المختلفة، مثل TX/TL أو حتى PBS فقط يمكن استخدامها لتشكيل أوعية. وبالنسبة لكلا الحلين، فإن تحديد الحجم هو خطوة مباشرة إلى الأمام. يظهر تشتت الضوء الديناميكي أن الفُيصلات التي تم إعدادها بدون طريقة الخرز الزجاجي ينتج عنها قطر 134 نانومتر، مع تعدد التخصصات من 25٪ عندما يتم استخدام الخرز الزجاجي، يؤدي القطر في 168 نانومتر، مع تعدد 21٪ كثافة الفلوريسنس من اثنين من البروتينات الفلورية، والتي يتم التعبير عنها داخل vesicles ELP، ثم يتم قياس باستخدام قارئ لوحة الفلوريسين.

من المهم أن نلاحظ أنه بعد تشكيل الفحوى ، فإن محتويات الفحوى والحل الخارجي هي نفسها ، وبالتالي ، يضاف المضاد الحيوي Kanamycin إلى الحل الخارجي لقمع التعبير البروتيني. كتحكم، يتم إضافة كاناميسين أيضا إلى حل تورم، وفي هذه الحالة يتم قمع التعبير البروتين داخل من الفينة. وهذا يدل على أن كاناميسين لا ينتشر من خلال الغشاء، ويقمع التعبير الداخلي باستمرار، في كل وقت.

ثم يتم إجراء فحص فريت لإثبات دمج ELP في الغشاء. عند التعبير عن ELPs الغشاء، الببتيدات إضافية دمج في الغشاء، مما يزيد من متوسط المسافة بين أزواج فريت، والذي يؤدي إلى زيادة إشارة المانحة. ويمكن استخدام هذه التقنية المقدمة لإنتاج حاويات رد فعل بسيطة أو لإنشاء خلايا اصطناعية مع أغشية تعتمد على الببتيد.

يمكن اختيار المحتوى داخل حسب الحاجة. باستخدام هذه الفاتيد vesicles، يمكننا الآن نتطلع إلى الأمام على تفاعلات التوليف أكثر تعقيدا داخلها.