إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

يوفر هذا سير العمل الآلي هضم انزيمية البروتين متسقة مع استنساخ ممتازة والإنتاجية. وهذا يحسن دقة وموثوقية اكتشاف العلامات الحيوية، والتحقق من الصحة، والتطبيق السريري بواسطة القياس الطيفي الشامل. وميزة هذه التكنولوجيا هو أن سير العمل بأكمله يمكن أن تكتمل لعينات 96 في حوالي خمس ساعات مع داخل-فحص وفيما بين-اختبار السيرة الذاتية من أقل من 20٪ بالنسبة لغالبية البروتينات.

هذا إعداد عينة عالية الإنتاجية دقيقة تمكننا من التحقيق في البروتيومات المرض من الأنسجة أو biofluids على نطاق أوسع. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر سير عمل إعداد العينات البروتيومية الآلية أساسًا متينًا للمحتوى العالي وتحليلًا كميًا للبروتيوم. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون الدكتور تشين فو، مدير مركز الإنتاجية العالية في سيدار سيناي والسيد كايسي جونسون، وهو باحث مشارك في مختبري.

قبل البدء في التحليل، إضافة خمسة ميكرولترات من البلازما البشرية الصحية المجمعة في 96 جولة عميق لوحة البروبيلين. عند تحميل كافة العينات، افتح برنامج جهاز معالج السائل وتحت علامة التبويب Method ، حدد كافة المحاور الرئيسية لتوجيه معالج السائل التلقائي. تأكد من أن كافة المحاقن محطة العمل تحتوي على أي فقاعات الهواء مرئية وفتح طريقة جديدة وانقر فوق تشغيل لبدء الأسلوب.

أدخل صواب في إدخال قيمة لاستخدامها في مطالبة autosampler أن يكون لوحةampler أعدت في نهاية الأسلوب ثم انقر فوق موافق. أدخل واحدة في إدخال قيمة لاستخدامها في موجه العمود الأول وانقر فوق موافق. أدخل 12 في إدخال قيمة لاستخدامها في المطالبة بالعمود الأخير وانقر فوق موافق. إذا كان يتم استخدام لوحة عينة مع وحدات تخزين عينة من 20 ميكرولترات على الأقل، أدخل true في إدخال قيمة لاستخدامها للوحة العينة المطالبة وانقر فوق موافق. اتبع الإرشادات في إطار إعداد Labware الموجهة ثم انقر فوق متابعة. قم بتحميل الكواشف المناسبة في الآبار المناسبة وانقر فوق التالي. انقر فوق التالي مرة أخرى لوضع سطح السفينة معالج السائل الآلي كما يتضح بما في ذلك الكاشف، رد فعل، عينة، ولوحات autosampler، ستة-بئر 90 صناديق تلميح ميكرولتر، فارغة 90 صندوق تلميح ميكرولتر، وكامل 230 ميكرولتر تلميح مربع.

ثم انقر فوق إنهاء لبدء الأسلوب. في المتابعة بعد موجه الطرد المركزي، استرداد لوحة التفاعل ووضع لوحة في جهاز الطرد المركزي. في نهاية الطرد المركزي، ارجع لوحة التفاعل إلى موضعها داخل معالج السائل التلقائي وانقر فوق متابعة.

بالنسبة للتحليل الطيفي الكتلي الكتلي وتحلل الببتيدات في عمود C18 2.1 في 100 ملليمتر 3.5 ميكرومتر بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط عالية التدفق بمعدل تدفق 250 ميكرولتر في الدقيقة وتحليلها في خط على مطياف كتلة رباعية ثلاثية. خمس دقائق بعد التحميل، اكويتبر العمود مع 5٪ حل B العازلة و elute الببتيدات مع تدرج خطي 5-35٪من المخزن المؤقت B أكثر من 30 دقيقة. في نهاية elution، وغسل العمود مع 98٪ المخزن المؤقت B لمدة 10 دقائق تليها غسل لمدة خمس دقائق مع 5٪ المخزن المؤقت B قبل تحميل العينة التالية.

لتحويل الانترنت، واستخدام صمام التبديل على مرحلتين لتحويل eluent ما بعد العمود إلى النفايات قبل أن يدخل مصدر أيون. عندما تم توضيح جميع العينات ، يمكن معالجة بيانات رصد ردود الفعل المتعددة. في هذا التحليل التمثيلي، تم رصد ثلاثة ببتيدات بيتا غال واثنين من الببتيدات الألبومين من ارتفعت بيتا غال و بروتينات البلازما المجهزة.

تم حساب دقة سير عمل إعداد العينة الآلي كمبلغ في معامل التباين في إجمالي سير عمل مراقبة التفاعل المحدد من البروتيومي ناقص معامل النسبة المئوية للتباين في قياس الطيف الكتلي الكتلي اللوني السائل. كما هو متوقع، لوحظت كثافة إشارة جيدة لكل من الزلال المصلي البشري و بروتينات بيتا غال. لرصد دقة خطوات نقل السائل، يمكن أن ترتفع معايير الببتيد المستقرة التي تحمل التسمية النظائر لألبومين المصل البشري الداخلي وبروين بيتا غال الخارجية في خطوات نقل الكاشف المستقل.

وللتأكد من سير العمل الآلي لإعداد العينات البروتومية، تم حساب معامل قيم الفرق خلال اليوم من 21 بئراً تم إعدادها في اليوم نفسه. متوسط معامل التباين في اليوم اليومي لـ 40 بروتينًا تراوح بين 4-20٪ لتقييم تأثير حافة سير العمل الآلي القائم على اللوحة، يمكن حساب النسبة المئوية للمعامل من التباين من آبار محددة داخل أعمدة وصفوف معينة. في هذه التجربة التمثيلية ، كانت كثافة إشارة مراقبة التفاعل المتعددة متشابهة في جميع تكوينات العمود والصف مع معامل النسبة المئوية للتباين الذي يتراوح بين 3-22٪أهم الخطوات هي إضافة عينة بشكل صحيح وفقًا لخريطة اللوحة المطلوبة 96-well وإعداد لوحة الكواشف بشكل صحيح وفقًا للتعليمات التي يقوم بها البرنامج.

تسمح طريقة إعداد عينة البروتيوم المؤتمتة هذه للباحثين بجمع بيانات بروتيوميات موثوقة وكمية على نطاق واسع.