الكشف عن نشاط الرجعية من الخط الساخن-1S من قبل لمسافات طويلة معكوس PCR

يمكن لهذا الأسلوب الكشف عن نشاط التحولات الرجعية يسمى LINE-1s. هذه العناصر الوراثية المتنقلة تسبب الإدخالات من جديد في الجينوم السرطان وبالتالي تسهم في عدم الاستقرار الجينومي. وميزة هذه التقنية القائمة على PCR هي أنها بسيطة وفعالة من حيث التكلفة مقارنة بنهج تسلسل الإنتاجية العالية.

نحن نبرهن هنا فائدتها في الكشف عن الإدخالات من جديد التي تنشأ من LINE-1 داخل الجين TTC28 على الكروموسوم البشري 22. يمكن أن يكون نشاط LINE-1 بمثابة علامة بيولوجية للتشويه أو ما قبل الخبيثة خاصة في أنواع الأورام الظهارية ، مثل سرطان القولون أو سرطان المبيض المصلي عالي الجودة. بالإضافة إلى عمليات الإدراج في LINE-1، يمكن لهذه الطريقة اكتشاف الانحرافات الجينومية الأخرى، مثل إعادة ترتيب الحمض النووي التي تحتاج دائمًا إلى إعادة ترتيب لسبب ما.

من أجل تحديد إنزيم تقييد مناسبة، وتصميم التمهيديات العكسية، أولاً، تحميل TTC28 LINE-1 التسلسل في شكل FASTA من قاعدة بيانات LINE-1، مثل L1Base. معرف L1Base لـ TTC28 الخط-1 هو 135. وتشمل خمسة كيلوباسس تسلسل، يحيط كل من خمسة رئيس الوزراء وثلاثة رئيس، نهاية تسلسل الخط-1.

تصدير التسلسل إلى معالج نصوص. هنا هو مشروح تسلسل الخط 1 يحيط بخط بني وتسلسل الخط 1 في الخط الرمادي. لتحديد العلامة الفريدة في تسلسل كيلو بيس واحد من TTC28 الخط -1 ثلاثة رئيس الوزراء وإلى واحدة من أدوات التنبؤ إشارة polyadenylation، مثل Polyadq أو التنين بوليا ساتر.

اُنشير إلى جميع إشارة تعدد الحساسية في نافذة كيلوس. التسلسل بين TTC28 خط -1 الخاصة إشارة polyadenylation ضعيفة أبرزت هنا باللون الوردي وأقوى إشارة تعدد الصناعات التحويلية هو علامة فريدة من هذا الخط -1 أبرز هنا باللون الأصفر. لتصميم التمهيديات PCR العكسي أدخل تسلسل العلامة الفريدة في أداة تصميم التمهيدي على شبكة الإنترنت، مثل NCBI التمهيدي-انفجار الذي يولد التمهيديات PCR محددة، والحفاظ على المعلمة طول المنتج إلى الحد الأدنى لإظهار أزواج التمهيدي قريبة من بعضها البعض.

حدد قاعدة بيانات الجينوم المناسبة. كما أن الناتج من انفجار التمهيدي يولد التمهيديات PCR التقليدية التي تواجه بعضها البعض، واستخدام وظيفة تكملة عكسي لزوج التمهيدي لأداء PCR العكسي. البدّاءات التصميمية البينية، المقابلة لإشارة التعدد الـمُشرقي كلما أمكن ذلك.

لقد تكرمنا ثلاثة أزواج التمهيدي، وأبرز في البط البري والأخضر، المقابلة لإشارة قوية ثلاثة polyadenylation في العلامة الفريدة من TTC28 LINE-1. بعد ذلك ، لتحديد إنزيم تقييد مناسب ، هضم تسلسل LINE-1 ، جنبا إلى جنب مع جناحيها الخمسة كيلو بيس في السيليكا باستخدام أدوات مستندة إلى الويب ، مثل RestrictionMapper. وهذا سوف يعطي قائمة شاملة من الإنزيمات المقيدة التي تهضم هذا السبب، وتوليد شظايا تقييد مختلفة.

حدد الإنزيمات التي تجعل من خمسة رئيس قطع المنبع من خط - 1 خمسة رئيس نهاية أو نحو خمسة رئيس نهاية LINE - 1 إذا كان داخل LINE - 1 نفسها. وثلاثة رئيس بطاقة المصب حتى من العلامة الفريدة. وينبغي أن لا يكون جزء القيد الأصلي مع تسلسل LINE-1 وعلامته الفريدة التي صنعتها أنزيمات التقييد الانتقائية، أطول من 12 كيلوباس، لأنه قد لا يتم تضخيمه بواسطة PCR بكفاءة.

لاحظ أن إنزيمات التقييد الانتقائية ستكون غير حساسة لتكيثيل الحمض النووي ، وينبغي أن تكون غير قابلة للتكرار للحرارة ، وينبغي أن تولد نهايات لزجة مكملة لبعضها البعض. من أجل إظهار البعد الطويل معكوس PCR، وسوف نستخدم إنزيم تقييد SacI أن يقطع الحمض النووي في مواقع DAZCTC أبرز هنا باللون الأخضر الفاتح. SacI يفي بجميع المعايير في TTC28 LINE-1 مكان وتولد جزء من تقييد الأصلي 5، 700 أزواج قاعدة.

استخراج الحمض النووي الجينومي من عينات باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي المتاحة تجاريا التي هي قادرة على استخراج نوعية جيدة، والحمض النووي الجزيئي عالية ضرورية لمسافة طويلة معكوس PCR. هنا قمنا باستخراج الحمض النووي الجينومي من MCF7 خط خلايا سرطان الثدي والدم البشري العادي باستخدام تعليمات التصنيع. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام الفلوروميتر.

10000 نانوغرام الحمض النووي على شخص واحد agarose هلام جنبا إلى جنب مع علامة الوزن الجزيئية الحمض النووي للتحقق من نوعية الحمض النووي وكميته. لجعل قوالب الحمض النووي دائرية، هضم أولا الحمض النووي مع إنزيم تقييد مناسبة. هنا نستخدم SacI لهضم MCF7 والحمض النووي الجينومي الدم جعل مزيج رد فعل الهضم وفقا لبروتوكول النص.

اخلط الحل عن طريق النقر على الأنبوب والطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان مزيج التفاعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة تليها تنشيط الحرارة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. المقبل، وجعل التفاعل التفاعل خلط ماجستير حل وفقا لبروتوكول النص إلى ligate الذاتي الحمض النووي هضم.

لكل رد فعل، إضافة 30 ميكرولترات من هذا المزيج الرئيسي تفاعل الربط مباشرة إلى 50 ميكرولترات من حل الحمض النووي هضم من الخطوة السابقة. اخلط الحل عن طريق تمرير الأنبوب والطرد المركزي الأنبوب لفترة وجيزة. احتضان هذا المزيج التفاعل في دورة حرارية في 22 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، والانتهاء مع خطوة تنشيط الحرارة في 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أخرى.

سيتم استخدام قالب الحمض النووي الدائري هذا في الخطوة التالية PCR العكسي. تعيين تدرج درجة حرارة التلاهم في دورة حرارية لتحديد درجة حرارة الصلب التمهيدي الأمثل بواسطة PCR التدرج. إعداد مزيج رئيسي ل PCR عن طريق الجمع بين وخلط جميع المكونات وفقا لبروتوكول النص.

إعداد رد فعل واحد لكل درجة حرارة في الانحدار. لكل رد فعل، تخصيص 19 ميكرولترات من أنابيب PCR خلط الرئيسي وإضافة ميكرولتر واحد من قالب الحمض النووي الدائري، ولدت من الحمض النووي الجينومي الدم. تشغيل التدرج PCR البرنامج.

تشغيل ستة ميكرولترات من المنتج PCR، تسخينه في درجة حرارة مختلفة في دورة واحدة في هلام agarose. للكشف عن دي نوفو TTC28 خط-1 إعادة التحول النشاط في الجينوم من خط الخلية MCF7، تنفيذ PCR باستخدام زوج التمهيدي العكسي على قوالب الحمض النووي الدائري، ولدت من خط الخلية MCF-7. اتبع نفس التعليمات بالنسبة للتدرج PCR، ولكن هذه المرة استبدال تدرج درجة الحرارة مع درجة حرارة الصلب الأمثل، والتي هي 64 درجة مئوية.

تحليل منتجات PCR معكوس المسافة الطويلة بواسطة جل agarose للنتائج. تُظهر هذه الصورة هلام agarose التي تم التقاطها بعد الكهرباء الحمض النووي الجينومي المستخرج من MCF7 وعينات الدم لديها وزن جزيئي مرتفع ، مما يجعلها مناسبة ل PCR معكوس المسافة الطويلة. هذه الصورة هلام agarose التي اتخذت بعد electrophoreses يظهر أن الزوج التمهيدي العكسي الذي صممناه تضخيم القالب الدائري الصحيح في جميع درجات الحرارة في الانحدار كما لوحظ من قبل تمتد مكثفة بين 5 كيلوبيس وسبعة علامة الحمض النووي كيلو.

ومع ذلك ، لوحظ أيضا نطاقات مختلفة في درجات حرارة أقل ، مما يدل على سوء خصوصية التمهيدية وضعف درجات الحرارة الملين. وهكذا، لهذا الزوج التمهيدي، 64 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى. تُظهر هذه الصورة جل agarose منتج PCR الذي تم الحصول عليه بعد إجراء معكوس PCR على الحمض النووي المستخرج من الحمض النووي MCF7 والدم الطبيعي.

يمثل منتج PCF من أزواج أساسية 5,700، معلّم بعلامة نجمية، PCR الأصلي المقابلة إلى Line-1 في موضعه الأصلي. هذا المنتج PCR الأصلي مرئيا في كل من MCF7 والحمض النووي الدم الطبيعي. De novo LINE-1 إعادة التحول مرة أخرى والجينوم MCF7 يمكن الكشف عنها كمنتج PCR من مختلف الأحجام، جنبا إلى جنب مع المنتج PCR الأصلي في هلام agarose.

ويمكن أن يسمح تسلسل المنتج المعكوس للـ PCR من خلال تكنولوجيات التسلسل الطويلة القراءة الجزيئية أحادية المدى بتحديد هوية الهدف في حل محكم نووي. على الرغم من أن نهجا مرهقا، الاستنساخ وتسلسل السانجر من المنتج معكوس المسافة الطويلة PCR هو أيضا ممكن. في هذا الفيديو، تم الكشف عن نشاط LINE-1 على الكروموسوم 22.

يمكن تكييف نفس سير العمل لمراقبة أخرى LINE-1s التي تنشط في أنواع مختلفة من الأورام.