رواية نيكوتيناميد الدينين الدينوكليوتيد طريقة تصحيح لقياس Ca2 + داخل الخلايا مع Fura-2-التناظرية في الخلايا الحية
سبتمبر 20, 2019
ونظراً للتداخل الطيفي لموجات الإثارة والانبعاثات لنظائر NADH وfura-2، فإن تداخل الإشارة من كلتا الكيميائيتين في الخلايا الحية أمر لا مفر منه أثناء القياس الكمي [Ca2+]. وهكذا، تم تطوير طريقة تصحيح جديدة عبر الإنترنت لتداخل إشارة NADH لقياس [Ca2+] .
الأشعة فوق البنفسجية المجسات الجمع، لديها تلوث إشارة متأصلة، وذلك بسبب الأصوات الجمع التلقائي. معظم المشكلة مع NADH، هو الحد من استخدام مسبار الجمع. ويمكن استخدام طريقة، لتصحيح دقيق للفلوريس الخارجي من NADH، من أجل استخراج صحيح، غير مُلَكّع إشارة مسبار الجمع.
إثبات الإجراء سيكون جيونغ هون لي، أستاذ أبحاثنا المساعد من مختبري. بعد السماح myocytes لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب ، وpirnatate عظمى. تسمية الخلايا مع مليلترين من الطازجة أعدت واحد ملليمتر fura-2-FFAM تخفيف حل لمدة 60 دقيقة في أربع درجات مئوية.
في نهاية الحضانة، ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وضع مستقيم قبل إزالة المابير. ثم إضافة أربعة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة ثقافة المتوسطة للتخزين في درجة حرارة الغرفة. في الموقع isobestic الفورا-2-Ffa نقطة تحديد جبل الخلايا المخففة على مرحلة المجهر والانتظار ثلاث دقائق للخلايا لتغرق إلى أسفل.
افراط NADH خالية من 37 درجة مئوية خالية من الكالسيوم حل في الخلية ثقافة وتحديد خلية الهدف. محلول سابونين الزفير لمدة 60 ثانية قبل إعادة الإفراط مع محلول خالي من الكالسيوم الخالي من الكالسيوم من NADH. في وقت واحد قياس الإشارات المنبعثة من فورا-2-ff في 450 و 500 نانومتر، وذلك باستخدام مسح استثارة من 350 إلى 365 نانومتر مع خطوة 0.1 نانومتر وإعادة إسراف مع محلول خالية من الكالسيوم NADH.
طرح التالي الإشارات في محلول الكالسيوم المشبعة من الإشارات في ظروف خالية من الكالسيوم. ثم حساب الانحرافات المعيارية للانبعاثات عند كل استثارة وتحديد الطول الموجي الإثارة تبين الحد الأدنى من قيم الانحراف المعياري كنقاط اسكوبية فردية. لاستخدام نظام قياس متعدد الباراتترية للكشف عن إشارة الخلفية وتصحيح الإشارة داخل منطقة الخلية ، قم بتركيب خلايا خالية من الصبغة في حمام المجهر والسماح للخلايا بالاستقرار لمدة ثلاث دقائق.
وافرت ناده حل خالي من الكالسيوم في الحمام لمدة خمس دقائق بمعدل 2-3 ملليلتر في الدقيقة، وتعيين حقل الكائن لتغطية الخلية المستهدفة. بعد نقل الخلية من حقل قياس إشارات الخلفية من نافذة خالية من الخلايا وتعيين إشارات كما الإزاحات. ثم ارجع الخلية إلى الموضع الأولي وقم بقياس إشارات خلفية الخلية ومنطقة الخلية.
لحساب عامل R استخدام خلفية الخلية المكتسبة وإشارات المنطقة قبل إعادة تركيب الخلايا الخالية من الصبغة على المجهر والاستفادة مع محلول خال من الكالسيوم. قياس الإشارات كما هو مبين قبل الإسراف في تعليق الخلية مع حل malate. بعد قياس الإشارات بغزارة الخلايا مع محلول بيروفات تليها وفرة مع محلول malate-بيروفات ومحلول الروتينون.
ثم حساب الميل لكل إشارة. هنا تظهر التغيرات في الكالسيوم الميتوكوندريا قبل وبعد التصحيح. النتائج تكشف بوضوح عن تغييرات كبيرة في الكالسيوم الميتوكوندريا مع تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا يستريح دون الكالسيوم السيتوسولي من 1.03 زائد أو ناقص 0.13 ميكرومولار والحد الأقصى للكالسيوم الميتوكوندريا في واحد ميكرومولار من الكالسيوم 29.6 زائد أو ناقص 1.61 ميكرومولار.
تم رصد إمكانات عبر الميكوندرية مع وفرة من اثنين من نانومولار TMRE. تم حساب التغير في إمكانات الميتوكوندريا على أساس احتمال غشاء ميتوكوندريا أولي مفترض من ناقص 150 ملليفولت، مما يدل على انخفاض في NADH استجابة لإضافة الكالسيوم، مع تأثير سلبي على إمكانات غشاء الميتوكوندريا. لم يتأثر الجسم بالضمر الميتوكوندري بسبب الزيادة في الكالسيوم الميتوكوندريا الناجم عن تحميل الكاربوكسي SNARF-1.
نقاط isobestic غير صحيحة ينتج تصحيح R و NADH غير صحيحة. لذا عليك أن تأخذ الحرص على قياس دائما بشكل صحيح في الخلفية خالية من الخلية ومنطقة الخلية. وتستخدم هذه التقنية في إعداد دراسات الكالسيوم الميتوكوندريا الديناميكية في الانسكابات البيولوجية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تتناول هذه الدراسة تحدي تداخل الإشارات الناتج عن NADH ونظائر fura-2 عند قياس تركيزات الكالسيوم في الخلايا الحية. وقد تم تطوير طريقة تصحيح فورية (online) مبتكرة لتحسين دقة قياسات [Ca2+] في ظل وجود تلوث في إشارة NADH.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- تداخل الإشارات في قياسات الفلورة
- قياس الكالسيوم في الخلايا الحية
- تطوير تقنيات التصحيح
خلفية علمية
- يؤدي التداخل الطيفي بين أطوال موجات الاستثارة والانبعاث إلى تعقيد القياسات.
- يمكن أن يحد NADH من فائدة استخدام مجسات متعددة في المجهر الفلوري.
- تعد القياسات الدقيقة لـ [Ca2+] أمراً بالغ الأهمية في الدراسات الخلوية.
الطرق المستخدمة
- قياس الفلورة باستخدام fura-2
- المقايسات الخلوية باستخدام الخلايا العضلية
- تقنيات تصحيح الإشارة وقياس الخلفية
النتائج الرئيسية
- لوحظت تغيرات جوهرية في تركيزات الكالسيوم في الميتوكوندريا.
- تم تطوير نهج منهجي لتصحيح التداخل الناتج عن NADH.
- تم التحقق من صحة التقنية من خلال إجراءات تجريبية صارمة.
الاستنتاجات
- تثبت هذه الدراسة بنجاح طريقة لتحسين دقة قياس الفلورة.
- ولهذا دلالات هامة بالنسبة للتحليلات الكمية في علم الأحياء الخلوي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يُعد القياس الدقيق للكالسيوم داخل الخلايا أمراً حاسماً للتحقق من صحة الأهداف في عملية اكتشاف الأدوية، ولا سيما في مسارات التأشير الميتوكوندريا. ويسبب التألق الذاتي لـ NADH تداخلاً كبيراً في المقايسات القائمة على fura-2، مما يؤثر سلباً على موثوقية البيانات ويزيد من معدلات الإيجابيات الكاذبة في عمليات الفرز الأولية. وتعزز طريقة تصحيح NADH هذه من الثقة التنبؤية عن طريق عزل إشارات الكالسيوم الحقيقية، مما يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية في برامج استهداف أمراض القلب والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء التعامل مع الكالسيوم في الميتوكوندريا كفرضية علاجية في نماذج الأمراض.
- القيمة التشغيلية: تقلل من الغموض الميكانيكي من خلال فصل الفلورة الذاتية لـ NADH عن إشارات fura-2 الحقيقية.
- القيمة التنبؤية: تعزز الثقة في الهدف من خلال قياسات كمية لتدفق الكالسيوم خالية من التداخل.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: يعمل على تجهيز الأنظمة البيولوجية المعتمدة لعمليات فحص المركبات اللاحقة من خلال تحديد مستوى الأساس لفلورة NADH المصححة.
- قابليّة التكرار: يوحد عملية اختيار طول موجة الإثارة عبر تحديد النقطة المتساوية الامتصاص (isobestic point)، مما يقلل من التباين بين المقايسات.
- قدرة التعددية: يدعم القياس المتزامن لـ NADH، والكالسيوم، و pH أو جهد الغشاء باستخدام مجموعات متميزة من الإثارة والانبعاث.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: قابلة للتطبيق بشكل مباشر على نماذج الخلل الوظيفي الميتوكوندري في الاضطرابات التنكسية العصبية والاضطرابات الأيضية.
- الاستمرارية الانتقالية: تربط بين ملاحظات تدفق الكالسيوم في مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري باستخدام إشارات fura-2-FF المصححة.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يتيح اتخاذ قرارات أكثر موثوقية بشأن الاستمرار من عدمه (go/no-go) من خلال تقليل الإشارات الخاطئة في فحوصات كالسيوم الميتوكوندريا.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضيات الأهداف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى التحقق الميكانيكي قبل السريري، وتحديداً بالنسبة لأهداف الميتوكوندريا.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم توضيح المسارات من خلال عزل الإشارات المعتمدة على الكالسيوم عن التداخلات الأيضية في مقايسات الخلايا الحية.
- الفحص: يعزز جاهزية المقايسة من خلال طرح الخلفية وتصحيح الإزاحة، مما يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء لتقييم المركبات.
- التحليلات: يتيح قياسات نسبية كمية عبر حساب عامل R باستخدام الانبعاث المصحح عند 450 nm و 500 nm.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بالعمل قبل السريري من خلال المراقبة المتزامنة للكالسيوم وجهد الغشاء الميتوكوندري باستخدام TMRE.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس إطار عمل تصحيحي قابل لإعادة الاستخدام، يمكن تطبيقه عبر أنواع الخلايا والمجسات الفلورية المعرضة لتداخل NADH.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق التخلص من النتائج الإيجابية الكاذبة التي يسببها NADH في إشارات الكالسيوم.
- القيمة التشغيلية: تحسن توحيد المقايسة وقابلية تكرارها من خلال التحديد المنهجي للنقطة المتساوية اللون (isobestic point) وطرح الخلفية.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم اتخاذ قرارات "المتابعة أو الإيقاف" (go/no-go) بشكل أفضل عن طريق تقليل الضجيج البيولوجي في مراحل الفرز الأولية.
- التأثير على المحفظة: تتيح ترتيب أولويات الأهداف الميتوكوندرية بناءً على المخاطر المعدلة من خلال قراءات وظيفية موثوقة وخالية من التداخلات.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في المجهر الفلوري والتعامل مع المسبارات النسبية (ratiometric probes).
- تستلزم وجود أجهزة قادرة على الإثارة بمسح الطول الموجي (350–365 nm) والكشف عن انبعاث مزدوج (450 nm, 500 nm).
- تتطلب توحيد معايير قياس إشارة الخلفية وبروتوكولات تصحيح الإزاحة بين الفرق البحثية.
- تتضمن اعتبارات التكييف عند تطبيق الطريقة على سير عمل مختلف لتحضير الخلايا الخالية من الأصباغ.
- تعتمد على القياس الدقيق لإشارات الخلفية الخالية من الخلايا وإشارات منطقة الخلايا لتجنب الاختيار الخاطئ للنقطة المتساوية الامتصاص (isobestic point).
