توليف معيار مبتور للكم من 2-Arashidonoylglycerol في Caenorhabditis elegans

إندوكانابينويدات هي وسطاء الدهون المحفوظة التي تنظم العمليات البيولوجية المتعددة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. أول endocannabinoids المكتشفة هي أنانداميد و 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. الخيط من النياتود C.elegans هو نموذج حيواني قوي لدراسة مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية.

في الآونة الأخيرة، اكتشفنا أن 2-AG يلعب دورا أساسيا في تنظيم الاتجار بالكولسترول في C.elegans. هذا هو السبب في أنه أصبح من الضروري تصميم وتحسين طريقة لدراسة الذاتية 2-AG عن طريق الكشف عن وتكميم في C.elegans. 11- وعادة ما تشمل الأساليب التحليلية التي سبق الإبلاغ عنها لقياس كمية 2-AG في العينات البيولوجية استخدام معايير مُتَرَكَّرة تجارياً، لكي تكون متاحة للشراء.

ومع ذلك، فهي مكلفة، ونظرا لوجود العديد من السندات المزدوجة، حساسة للحصول على المؤكد مع مرور الوقت. وتستند النسخة الأكثر شيوعا من المعايير على حمض arachidonic octadeuterated كونها مناسبة للتموين الكمي عن طريق تخفيف النظائر، عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة، ومطياف الكتلة الخلفية. للتغلب على الصعوبات المرتبطة بتكلفة واستقرار المعايير deuterated لتحديد كمية 2-AG، استخدمنا طريقة مريحة وبسيطة لإعداد معيار تحليلي يستند إلى deuterium-5-الجلسرين.

يتطلب تسلسل لإعداد معيار منجل إجراء الخطوات الثلاث. إمكانية الاحتفاظ بها في النموذج المحمي حتى تكون هناك حاجة إليها. الهدف الرئيسي من هذا العمل هو إظهار طريقة كاملة لدراسة 2-AG في C.elegans من توليف المعيار التحليلي deuterated لإعداد واستخراج عينات الخيطيات وأخيرا، والتحليل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة والمطياف الشامل.

للحصول على 1-AG deuterated كمعيار داخلي مُتَنَهَد لمقايسات القياس الكمي اتبع بروتوكول الخطوة الثلاث. من أجل حماية فقط الكحول الأولية، أولا إضافة 38 ملليغرام من الجلسرين deuterated إلى أنبوب رد فعل 10 ملليلتر باستخدام ماصة باستور وإضافة مُنذر مغناطيسي. بعد ذلك، أضف خمسة ملليلتر من DCM اللامائية باستخدام حقنة هاملتون خمسة ملليلتر وملء الأنبوب بالنيتروجين الجاف لإعطاء جو خامل.

إعداد حمام باستخدام قارورة ديوار الضحلة مليئة خلات الإيثيل المقطر. ملء أنبوب التفاعل مغلقة بشكل رقي داخل الحمام وتبريده ببطء إضافة النيتروجين السائل إلى خلات الإيثيل حتى يتم تجميد المذيبات. الحذر، السائل يغلي بعنف في درجة حرارة الغرفة، ويمكن أن يسبب حروق شديدة إذا في اتصال مع العينين والجلد.

بعد ذلك، أضف 54 ملليغرامًا من الاصطدام اللامائية باستخدام حقنة هاملتون. الحذر، والاصطدام متقلبة ولها رائحة قوية جدا وغير سارة. في 70 ملليغرام من تيربوتيل-ديميثيل-سيتيلكلوريد ويحرك كل شيء لمدة ثلاث ساعات في ناقص 78 درجة على مُنقل مغناطيسي.

إضافة مليلتر اثنين من محلول ملحي لإخماد رد الفعل. استخراج الحل مع مليلترين من ثنائي كلوروميثان المقطر ثلاث مرات باستخدام قمع منفصلة حفظ المستخلصات العضوية في كل مرة. ثم، والجمع بين مستخلصات العضوية الثلاثة وتجف على كبريتيت الصوديوم.

تنقية الخليط الخام حسب الكروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا كمرحلة ثابتة و10٪ زيادة الهيكسين خلات التدرج بدءا من 100٪ hexane والتشطيب مع 100٪ خلات الإيثيل. لهذه الخطوة استرة، إضافة 10 ملليغرام من المنتج ذكر سابقا إلى أنبوب تفاعل 10 ملليلتر باستخدام pippette باستور وإضافة مُحرك مغناطيسي. إضافة ملليلتر من DCM اللامائية باستخدام حقنة هاملتون خمسة ملليلتر وملء الأنبوب مع النيتروجين الجاف لإعطاء جو خامل.

تبريد الحل إلى الصفر درجة باستخدام حمام الجليد. إعلان 36 ملليغرام من حمض arachidonic باستخدام ميكروبليت قابل للتعديل متعددة الحجم ويحرك. ثم، إضافة 15 ملليغرام من 40-ميثيل-أمينوبريدين ويحرك.

إضافة 15 ملليغرام من diacyl بروبيل كاربوديميد باستخدام ميكرويبيت قابل للتعديل متعددة الحجم ويحرك. إضافة ملليلترين من الماء لإخماد رد الفعل ثم استخراج الحل مع مليلترين من المقطر DCM ثلاث مرات باستخدام قمع فصل. الجمع بين مستخلصات العضوية الثلاثة والجافة على كبريتيت الصوديوم، وتنقية الخليط الخام حسب الكروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا كمرحلة ثابتة ثم زيادة 10٪ تدرج خلات الإيثيل الهيكسان بدءا من 100٪ هيكسان والانتهاء مع 50 50٪ هيكسان خلات الإيثيل.

وأخيرا، بالنسبة لخطوة إزالة الحماية، إضافة 15 ملليغرام من المنتج توليفها سابقا إلى أنبوب تفاعل 10 ملليلتر باستخدام ماصة باستور وإضافة مُنَجِّر مغناطيسي. إضافة ملليلترين من رباعية هيدروفوران اللامائية باستخدام حقنة هاملتون خمسة ملليلتر وملء الأنبوب مع النيتروجين الجاف لإعطاء جو خامل. ثم تبريد الحل إلى الصفر درجات باستخدام حمام جليدي.

إضافة 150 ميكرولترات قطرة الحكمة من محلول واحد الضرس من فلوريد رباعي البوتيوم في THF باستخدام حقنة هاملتون. بعد ساعة واحدة، إضافة ملليلتر من الماء لإخماد رد الفعل. استخراج الحل مع اثنين ملليلتر المقطر DCM ثلاث مرات باستخدام مسار فصل القمع.

الجمع بين مستخلصات العضوية الثلاثة وتجف على كبريتيت الصوديوم. لإجراء التبييض، بدوره الديدان على بذور ستة سنتيمترات لوحات NGM. السماح للدودة أن تنمو من يومين إلى ثلاثة أيام بحيث يكون هناك الكثير من البيض والبالغين جرافيد على لوحة.

مرة واحدة لديك الكثير من البيض والبالغين، صب خمسة ملليلتر من M9 على لوحة. باستخدام ماصة زجاجية، نقل الديدان إلى أنبوب صقر 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة دقيقتين في 2،000 G وبيلي الديدان.

شفط معظم M9 دون إزعاج بيليه دودة. إضافة ثلاثة ملليلترات من حل التبييض وخلط الحل بلطف عن طريق عكس لمدة خمس دقائق تقريبا أو حتى ترى انخفاضا في عدد الديدان الكبار سليمة. مرة واحدة قد حل معظم الهيئات، الطرد المركزي في 2،000 G لمدة دقيقة واحدة.

شفط معظم محلول التبييض دون إزعاج بيليه الدودة. إضافة 15 ملليلتر من M9 إلى الأنبوب واخلط جيدا. جهاز طرد مركزي مرة أخرى في 2،000 G لمدة دقيقة واحدة.

شفط معظم M9 دون إزعاج بيليه دودة. لإعداد عينة دودة، واسمحوا الأجنة N2 التي تم الحصول عليها عن طريق إجراء التبييض كان في ليلة وضحاها في M9 العازلة في 20 درجة. ثم، حصاد متزامنة L1s عن طريق الطرد المركزي الأنبوب دقيقتين في 2، 000 G.Wash الديدان مع M9 العازلة مرة أخرى، وقياس عدد من L1 الحية. بذور ما يقرب من 10،000 الديدان في لوحات NGM مع ملليلتر واحد من OP 50 Escherichia القولونية المجففة سابقا.

احتضان لوحات على الأقل لمدة 48 ساعة في 20 درجة حتى الديدان تصل إلى مرحلة L4. حصاد الديدان باستخدام المخزن المؤقت M9 الباردة في أنبوب الصقر 50 ملليلتر. غسلها مرة واحدة أكثر ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.

بيليه الديدان عن طريق الطرد المركزي في 2، 000 غ لمدة دقيقة واحدة. القضاء على معظم المناط. ثم غمر الأنبوب في النيتروجين السائل ويحرك في ناقص 80 درجة.

ذوبان ما يقرب من 100 ميكرولترات من الكريات دودة المجمدة التي تنتمي إلى N2 ثم إضافة 1.3 ملليلتر من الميثانول. بعد ذلك، سونيكات العينة لمدة أربع دقائق. بعد سونيكيشن، إضافة 1، 000 ppb من معيار deuterated الداخلية، 2.6 ملليلتر من الكلوروفورم، و 1.3 ملليلتر من 0.5 مول من كلوريد البوتاسيوم، 0.08 مول من حمض الفوسفوريك إلى نسبة نهائية من واحد إلى واحد.

دوامة العينات لمدة دقيقة واحدة ثم سونيكات لهم في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة على الجليد. دوامة العينات مرة أخرى مرتين لمدة دقيقة واحدة والطرد المركزي لهم لمدة 10 دقائق في 2،000 G للحث على فصل المرحلة. جمع المرحلة السفلى في أنبوب زجاجي نظيف، وتجفيفه تحت النيتروجين، وإعادة نقيب في 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل.

لتحقيق الكم الناجح من 2-AG الذاتية، كان من الضروري توليف انها التناظرية المشبعة باستخدام طريقة خطوة ثلاث. بعد ذلك، تمت إضافته إلى عينات الدودة، واستخراج وتحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء، إلى جانب قياس الطيف الكتلي. يستخدم كمعيار داخلي، كان 1-AG الاصطناعية أداة لقياس المستقلب الداخلي.

تم تحسين الأسلوب باستخدام التحولات ل2-AG و deuterated 1-AG حيث يتم فقدان جزيئات الجلسرين. 2-AG الذاتية من العينات C.elegans تم الكشف عنها بنجاح وكميا عن طريق التخفيف النظائري مع 1-AG توليفها كيميائيا باستخدام الكروماتوغرافيا السائل عالية الأداء مقترنة بالمسح الطيفي الشامل. تم إعداد عينة واحدة مع معيار deuterated 1-AG، في حين عينة اثنين دون المعيار.

وبما أن التركيز الأصلي للمعيار المُنَحَد في العينة الأولى وثلاثة كان من 000 1 جزء في المليار لكل من كل منه، فمن نسبة منطقة الذروة، من الممكن حساب التركيز الداخلي البالغ 2-AG في العينة التي تبلغ 340 جزء في المليار للعينة الأولى و360 جزء في المليار للعينة الثالثة، مما يعطي متوسط 350 جزء في المليار. وقد حسبت النسب كجودة بين مناطق الذروة من 2-AG و 1-AG، على التوالي، لعينتين معزولتين. كلاهما مع معيار deuterated وأضاف سابقا لاستخراج.

ونظرا لأهمية اكتشفت مؤخرا من 2-AG في تعزيز الاتجار بالكوليسترول ونقص المعلومات عن كيفية تأثير الدهون على هذه العملية, كان من الضروري وسيلة الكشف موثوق لهذا endocannabinoid. وكان نجاح تطوير طريقة بسيطة وقوية الاصطناعية ذكرت هنا للحصول على deuterated التناظرية 2-AG خطوة رئيسية في هذا البروتوكول. معظم الأساليب المبلغ عنها لتحديد أحادية الغالوريسيرول تنطوي على استخدام المعايير التحليلية المتاحة تجاريا, التي عادة ما تكون مكلفة وغير مستقرة في ظل ظروف التخزين العادية, مما يجعلها لا يمكن الوصول إليها للمختبرات ذات الميزانية المنخفضة.

ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تحل هذا من خلال اقتراح توليف المعيار باستخدام مواد بداية أكثر سهولة. الطريقة الاصطناعية هي مباشرة إلى الأمام دون الظروف المتطورة اللازمة، مما يجعلها مثالية ليتم تنفيذها في أي مختبر مع الحد الأدنى من المعدات والوصول إلى المواد المتفاعلة، حتى في ميزانية مخفضة. باختصار، يصف هذا الإجراء الجديد طريقة مباشرة إلى الأمام وقابلة للتكرار للكشف عن وقياس كمية 2-AG التي من شأنها أن تساعد على الإجابة على بعض الأسئلة التي أثيرت بعد وصف دور هذه endocannabinoids في الاتجار بالكولسترول في C.elegans.