التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد
September 28th, 2019
المقدمة هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين الشكل الأصلي ، بريفيبريلار ، والخلايا الليفية اميلويد ناضجه من الببتيدات مختلفه والبروتينات مع الميتوكوندريا معزولة من الانسجه المختلفة ومناطق مختلفه من الدماغ.
في هذا الفيديو، نحن وصف دراسة نموذجية لآلية سمية اميلويد على مستوى الغشاء باستخدام الميتوكوندريا الدماغ الفئران كنموذج بيولوجي في المختبر. على الرغم من تراكم التقرير وصف آلية الأغشية الانزعاجات بواسطة الأميلويد تجميع في نظم نموذج فوسفوليبيد درس مباشرة استهداف الأحداث التي تبدأ في تطوير الغشاء البيولوجي. في هذا الفيديو، ونحن وصف fibrils اميلويد من ألفا سينوكلين تحليل غشاء الميتوكوندريا الدماغ الفئران كنموذج بيولوجي في المختبر.
ونحن نعتقد أن الميتوكوندريا باعتبارها organelle مع أغشية جيدة اميز قد توفر مفيدة للغاية البيولوجية نموذج نظام للدراسات الجزيئية المتعلقة آلية السمية الخلوية اميلويد على مستوى الغشاء المتعلقة بأمراض الأعصاب. قطع رأس الجرذ مع مقصلة صغيرة وإزالة الدماغ من الجدول في غضون دقيقة واحدة من قطع رأس الفئران للحد من التدهور المحتمل لخصائص الميتوكوندريا. من المهم العمل بسرعة والحفاظ على كل شيء على الجليد طوال العملية.
غسل الأنسجة مرتين مع 30 ملليلتر من العازلة العزل. نقل إلى منقار يحتوي على عازلة العزل الباردة و mince ناعما الدماغ مع مقص. نقل تعليق الأنسجة إلى 20 ملليلتر التجانس الباردة dounce.
التجانس قطع الأنسجة باستخدام تسعة السكتات الدماغية صعودا وهبوطا مع آفة آلية. اترك الخليط على الجليد لمدة 30 ثانية تقريبًا بعد كل مجموعة من ثلاث ضربات تجانس لضمان بقاء التجانس باردًا. نقل المتجانس إلى أنبوب أجهزة طرد مركزي مُبردة مسبقاً وطاردة مركزية على 1,300 غ في أربع درجات لمدة ثلاث دقائق.
بعناية طارد المابير ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي المبردة مسبقا. جهاز طرد مركزي في 21،000 G في أربعة درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل السوبر و resuspend بيليه في متوسطة التدرج الكثافة عن طريق تحريك بلطف الخليط مع ماصة.
جهاز طرد مركزي في زاوية ثابتة الدوار في 30، 700 G في أربعة درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام ماصة باستور، وإزالة نهاية حادة من المواد المتراكمة في الجزء العلوي، والتي تحتوي في الغالب على الميلين. إضافة ثمانية ملليلتر العازلة العزل إلى كسر الميتوكوندريا في حين التحريك بلطف الخليط مع ماصة.
جهاز طرد مركزي في 16،700 G في أربعة درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بعناية supernatant، وترك بيليه فضفاضة أسفل دون عائق. إضافة ملليلتر واحد 10 ملليغرام لكل ملليلتر الدهنية خالية من الأحماض BSA إلى أنبوب الطرد المركزي في حين اثارة بلطف الخليط مع غيض من ماصة.
قم بتكفير وحدة التخزين إلى خمسة ملليلتر عن طريق إضافة مخزن العزل المؤقت. جهاز طرد مركزي في 6,900 G في أربعة درجة مئوية لمدة 10 دقائق. هذا ينبغي أن تنتج بيليه شركة.
Decant الماسخ وssuspend بلطف بيليه الميتوكوندريا في عازلة العزلة. تمييع المتجانسة الميتوكوندريا إلى مليغرام واحد لكل ملليلتر مع عازلة العزل الباردة ومكان في اثنين من أنابيب 1.5 ملليلتر, عادة 195 ميكرولتر من الميتوكوندريا لكل أنبوب. إضافة خمسة ميكروليتر 20٪ حجم لكل حجم تريتون X-100 إلى أنبوب واحد كتحكم إيجابي للحد الأقصى من نشاط الانزيم وخمسة ميكرولتر ديونسيد المياه إلى أنبوب آخر للسيطرة، تليها خلط مع مُحرك.
احتضان الأنابيب لمدة 10 دقائق في حمام الماء الدافئ تعيين إلى 30 Centigrade. بيليه الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي من الأنابيب في دوار زاوية ثابتة في 16، 000 G أربعة سنتيغراد لمدة 15 دقيقة. جمع بعناية عظمى الناتجة لتقييم نشاط الميتوكوندريا مالات dehydrogenase باستخدام المعايرة الطيفية القياسية المذكورة في الجزء التالي.
حساب سلامة الغشاء الميتوكوندريا على النحو التالي. لتحديد نشاط malate dehydrogenase, ماص 890 و 880 ميكرولتر 50 ملليمولار تريس-HCL العازلة إلى فارغة وعينة اختبار cuvettes على التوالي تليها 100 ميكرولتر 50 ملليمولار oxaloacetate و 10 ميكرولتر من 10 ملليمولر بيتا-NADH. وضع cuvettes في مقياس الطيفية والمرجع ضد فارغة.
إضافة 10 ميكرولتر الميتوكوندر المتجانسة التجانس واحد ملليغرام لكل ملليلتر لعينة من cuvette. على الفور مزيج من قبل عكس. انخفاض قياسي في الامتصاص بسبب أكسدة NADH عند 340 نانومتر لمدة دقيقة واحدة.
لالفا-سينوكلين الرجفان اميلويد، إضافة 294 ميكرولتر من محلول البروتين، 200 ميكرومولار إلى كل 1.5 ملليلتر أنبوب. ثم إضافة ستة ميكروليتر ThT الحل واحد ملليمتر. اخلط الحلول وحضن الأنابيب في ثيرمميكسير في 37 درجة مئوية تحت التحريك المستمر عند 800 دورة في الدقيقة.
بالنسبة للرجفان الـفيني للأنسولين، أضف 637 ميكرولتر من محلول البروتين، و250 ميكرومولار إلى 1.5 ملليلتر. ثم إضافة 13 ميكروليتر ThT الحل واحد ملليمولار تليها التحريك. إضافة aliquots 200 ميكرولتر من حلول البروتين إلى كل بئر من لوحة 96-well السفلي واضحة.
ختم لوحة مع شريط ختم واضحة وضوح الشمس. تحميل لوحة في Cytation 5 قارئ لوحة الفلوريس. قياس الفلورس ThT على فترات 30 دقيقة لمدة 12 ساعة.
استخدام الإثارة في 440 نانومتر والانبعاثات في 485 نانومتر. حدد الآبار. هز اللوحة لمدة خمس ثوان قبل كل قياس.
تعيين درجة الحرارة في 57 درجة مئوية دون التحريض. إعداد اثنين من سلسلة من 1.5 ملليلتر أنابيب تحتوي على تجانس الميتوكوندريا, سلسلة واحدة لمقايسة الافراج عن MDH وغيرها لقياس الميتوكوندريا روس. إضافة aliquots من fibrils الطازجة أو اميلويد من ألفا-synuclein, الأنسولين البقري أو البيض البيض الدهاني lysozyme إلى المتوفيات المتينزية تليها الأنابيب بلطف.
ينبيّن أنابيب تحتوي على تعليق الميتوكوندريا لمدة 30 دقيقة في حمام الماء الدافئ الذي تم تعيينه إلى 30 درجة مئوية. بالنسبة لمقايسة إطلاق الانبعاثات من malate dehydrogenase، فإن أجهزة الطرد المركزي المحتضنة تتجانس الميتوكوندريا عند 16000 G لمدة 15 دقيقة. جمع بعناية عظمى الناتجة عن فحص نشاط MH الميتوكوندريا كما هو موضح في قسم البروتوكول الجزء الرابع.
حساب إصدار MDH كما يلي. لقياس الميتوكوندريا ROS، ماص 191 ميكرولتر من المتجانسة الميتوكوندريا المحتضنة إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا. إضافة أربعة ميكرولتر من 50 micromolar DCFDA.
ثم إضافة خمسة ميكرولتر من 200 ميليمولار كسيناث. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في حمام الماء الدافئ تعيين إلى 30 درجة مئوية في حين اثارة بلطف. تحميل لوحة في Cytation 5 قارئ لوحة الفلورانس وقياس كثافة الفلورانس وفقا لقسم البروتوكول.
تم تقييم سلامة غشاء الميتوكوندريا من خلال قياس نشاط MDH في الميتوكوندريا المعزولة قبل وبعد اضطراب الغشاء وإطلاق الإنزيم بواسطة Triton X-100. كما ترون، وجدنا عادة أن الاستعدادات الميتوكوندريا حوالي 93٪ سليمة. تم إجراء مقايسة ThT fluorescence لمراقبة نمو الفيبريات الأميلويد.
أظهر منحنى الرجفان الأميلويد من ثلاثة بروتينات نمطًا سيغريمي نموذجيًا ، ليصل إلى هضبة في حوالي 96 و 12 و 96 ساعة لـ ألفا سينوكلين ، وأنسولين الأبقار ، وبيضة البيض lysozyme على التوالي ، مما يشير إلى تشكيل fibrils الأميلويد الذي تم تأكيده أكثر من خلال قياس AFM. تم التحقيق في إمكانية تحقيض الغشاء الميتوكوندريا وتلفه بواسطة الفيبرلس الأميلويد من خلال إطلاق MH الميتوكوندريا وقياس الميتوكوندريا ROS. كما ترون في الرسم البياني الأيسر، لوحظ إصدار كبير من MDH عند إضافة ألفا سينوكلين فيبريه إلى الميتوكوندريا.
في حين تم الكشف عن إطلاق سراح طفيف من قبل فيبريلس الأنسولين، تم العثور على البيض البيض lysozyme fibrils غير فعالة. الرسم البياني الأيمن يظهر تأثير fibrils اميلويد على محتوى ROS الميتوكوندريا. في حين لم يلاحظ أي تحسن كبير في الميتوكوندريا ROS عند إضافة البيض البيض lysozyme أو الانسولين اميلويد فيبريلس, العلاج مع ألفا-سينوكلين فيبريلس أدى إلى زيادة كبيرة في محتوى روس من الميتوكوندريا الدماغ.
يصف هذا الفيديو دراسة نموذجية لآلية السمية الخلوية الكلية للظيّل على مستوى الغشاء، مما يوضح كيف أن الـ fibrils الأميلويد الناشئة عن البروتينات المختلفة قد تسبب درجات مختلفة من تلف الغشاء و permeabilization. في حين أن بعض المواضيع من fibrils اميلويد والغشاء المحدد ملزمة يبدو أن توفر القدرة على التفاعل مع وتسبب زعزعة الاستقرار والتمزقات اللاحقة من الأغشية. بعد هذا الفيديو، سوف تكون قادرة على التحقيق في التفاعل من شكل الأصلي، قبل الفيبريلار، و fibrils الأميلويد ناضجة من الببتيدات المختلفة ومع الميتوكوندريا معزولة عن الأنسجة المختلفة أو مناطق مختلفة من الدماغ.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
يدرس هذا البروتوكول التفاعلات بين ألياف الأميلويد والميتوكوندريا المعزولة من أنسجة الدماغ المختلفة. ويركز على آلية سمية الأميلويد على مستوى الغشاء باستخدام الميتوكوندريا من أدمغة الفئران كنموذج في المختبر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الأمراض التنكسية العصبية
الخلفية
- من المعروف أن تجميعات الأميلويد تعطل الأغشية البيولوجية.
- فهم تفاعلها مع الميتوكوندريا ضروري لدراسة الأمراض التنكسية العصبية.
- توفر الميتوكوندريا من أدمغة الفئران نموذجًا موصوفًا جيدًا لهذه الدراسات.
- العزل السريع للميتوكوندريا ضروري للحفاظ على خصائصها.
غرض الدراسة
- استكشاف آلية سمية الأميلويد على غشاء الميتوكوندريا.
- استخدام الميتوكوندريا من أدمغة الفئران كنموذج بيولوجي لهذه الدراسة.
- تحليل تأثيرات ألياف الأميلويد المختلفة على سلامة الميتوكوندريا.
الطرق المستخدمة
- عزل الميتوكوندريا من أنسجة الدماغ في الفئران.
- تحليل ألياف الأميلويد للسينوكلين ألفا.
- تجارب في المختبر لتقييم الاضطرابات في الغشاء.
- الحفاظ على درجات حرارة منخفضة لمنع تدهور الميتوكوندريا.
النتائج الرئيسية
- توصيف تأثيرات ألياف الأميلويد على أغشية الميتوكوندريا.
- أدلة على الاضطرابات في الغشاء الناتجة عن تجميعات الأميلويد.
- رؤى حول العلاقة بين سمية الأميلويد ووظيفة الميتوكوندريا.
- تأسيس نموذج موثوق في المختبر للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- تعمل الميتوكوندريا كنموذج قيم لدراسة سمية الأميلويد.
- فهم هذه التفاعلات قد يؤدي إلى رؤى حول الآليات التنكسية العصبية.
- يمكن للبحوث المستقبلية البناء على هذا النموذج لاستكشاف الاستراتيجيات العلاجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol provides a biologically relevant in vitro model to assess amyloid-induced mitochondrial membrane permeabilization, a key mechanism in neurodegenerative disease pathology. By using isolated rat brain mitochondria, the approach enables direct evaluation of amyloid fibril interactions with native organelle membranes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The structure-dependent effects observed—particularly with alpha-synuclein fibrils—offer predictive insights for prioritizing therapeutic candidates based on mitochondrial toxicity profiles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of amyloid fibril interactions with mitochondrial membranes to clarify structure-toxicity relationships.
- Operational Value: Provides a reproducible assay for assessing mitochondrial integrity via MDH release and ROS generation as functional readouts.
- Predictive Value: Supports early identification of amyloid species with high membrane-disrupting potential, informing lead selection and de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized workflow for preparing brain mitochondria with confirmed membrane integrity for downstream compound or fibril screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable endpoints—MDH release and ROS fluorescence—that enable dose-response and comparative analysis across amyloid preparations.
- Scalability: The protocol supports multi-well formats (e.g., 96-well plates) for ROS measurement, facilitating medium-throughput screening of fibril variants or inhibitory compounds.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models a proposed mechanism of amyloid toxicity in neurodegenerative diseases, linking in vitro findings to pathophysiological processes.
- Translational Continuity: Supports biomarker-aligned studies by quantifying mitochondrial dysfunction, a feature observed in patient-derived models and clinical specimens.
- Preclinical De-risking: Helps prioritize amyloid-targeting interventions by identifying fibrillar forms most likely to impair mitochondrial function in relevant tissue contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, particularly after target engagement and before lead optimization, by providing mechanistic insight into amyloid-induced organelle damage. It complements biochemical and cellular assays by adding a native membrane context to toxicity assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on amyloid-mitochondria interactions and pathway clarification related to oxidative stress and bioenergetic failure.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility testing when evaluating compound effects on amyloid-induced mitochondrial permeabilization.
- Analytics: Generates quantitative readouts (MDH activity, ROS levels) that allow comparison of toxic potential across amyloid preparations or genetic variants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling a conserved mechanism of mitochondrial dysfunction seen in neurodegenerative disease models.
- Enterprise Reuse: The mitochondrial isolation and integrity validation steps create a reusable platform applicable to other amyloidogenic proteins or tissue-specific mitochondria.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking amyloid fibril structure to mitochondrial membrane disruption.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized isolation, integrity confirmation (MDH activity), and controlled incubation conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying amyloid species with high mitochondrial toxicity potential, reducing investment in non-mechanistically relevant targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by flagging early signals of organelle-level toxicity that may predict late-stage safety concerns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation techniques and enzymatic activity assays to ensure preparation quality.
- Depends on centrifugation equipment capable of precise g-forces and temperature control (4°C) to maintain mitochondrial integrity.
- Necessitates standardization across teams for membrane integrity assessment (e.g., MDH activity thresholds) to enable cross-study comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the model to mitochondria from different brain regions or species, which may affect baseline susceptibility.
- Limited by the in vitro nature of the model, which may not fully capture dynamic cellular environments or compensatory mechanisms present in vivo.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:10
Brain Homogenization and Mitochondrial Isolation
4:33
Mitochondrial Membrane Integrity Determination
5:58
Malate Dehydrogenase Activity Determination
7:07
In vitro α-synuclein, Bovine Insulin, and HEWL Fibril Formation
10:11
Treatment of Mitochondria with Amyloid Fibrils, MDH Release Assay, and ROS Measurement
12:14
Results
14:07
Conclusion
