Name: فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: اكتشف بروتوكول فحص مثبطات الكيناز باستخدام مصفوفات NAPPA البروتينية عالية الإنتاجية. تتيح هذه الطريقة التعبير عن الكينازات البشرية النشطة لمقارنة تأثيرات المثبطات عبر أنواع متعددة من الكينازات ومتغيراتها السريرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويود المؤلفون ان يشكروا الجميع في مختبر لاباير علي مساعدتهم وانتقادهم اثناء تطوير المشروع. وقد تم دعم هذا المشروع من قبل منحه المعاهد القومية للصحة U01CA117374 ، U01AI077883 ومؤسسه فرجينيا ج. بايبر.

<ol><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting protein kinases.</a> Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).</li>
<li>Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.</a> Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).</li>
<li>Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA-approved+small-molecule+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacological+Sciencies%22%5BJournal%5D)">FDA-approved small-molecule kinase inhibitors.</a> Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).</li>
<li>Heinrich, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+c-kit+receptor+tyrosine+kinase+activity+by+STI+571%2C+a+selective+tyrosine+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor.</a> Blood. 96 (3), 925-932 (2000).</li>
<li>Stagno, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+frontline+treatment+and+long-term+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+Anticancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes.</a> Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).</li>
<li>Ben Ami, E., Demetri, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+safety+evaluation+of+imatinib+mesylate+in+the+treatment+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinions+in+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor.</a> Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).</li>
<li>Ramachandran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein microarrays.</a> Science. 305 (5680), 86-90 (2004).</li>
<li>Festa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+microarray+production+of+freshly+expressed+proteins+in+a+human+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu.</a> Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).</li>
<li>Rauf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+inhibition+of+ERBB4+reduces+cell+growth+in+a+WNT5A-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner.</a> Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).</li>
<li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+signature+of+autoantibody+biomarkers+for+the+early+detection+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer.</a> Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Autoantibodies+Associated+with+Basal-like+Breast+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prevention%22%5BJournal%5D)">Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).</li>
<li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li>
<li>Montor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+Pseudomonas+aeruginosa+outer+membrane+protein+immunogenicity+using+self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays.</a> Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).</li>
<li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28click+chemistry%29-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li>
<li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li>
<li>Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+B-cell+receptor+signaling+pathway+as+a+therapeutic+target+in+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL.</a> Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).</li>
<li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li>
<li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li>
<li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNASU+plasmid+and+PSI%3ABiology-Materials+repositories%3A+resources+to+accelerate+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li>
</ol>

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها وخلال مرحله التحسين في دراسة نشاط كيناز علي صفائف نابا ، كان أحد المصادر الرئيسية للخلفية والمدى الديناميكي المنخفض الذي لوحظ هو جيش صرب الجمهورية المستخدم في مزيج الطباعة. وكان الجيش الصربي البوسني يوفر الأمينات الاساسيه اللازمة للربط مع سطح امينوسيليكات وكان محاصره الحمض النووي والأجسام المضادة للقبض علي الفور. ومع ذلك ، فان الجيش الصربي البوسني هو الفوسفارلاتيد للغاية ، مما يجعل من الصعب للكشف عن اشاره اوتوفوسفرويليشن علي الصفيف فوق الضوضاء الخلفية. ولحل هذه المشكلة ، تم اختبار عده بدائل للجيش الصربي البوسني في مزيج الطباعة ، وتم تحديد بولي-ليسين كبديل جيد. بولي-يسين يفتقر إلى اي موقع فوسفرويليشن; لذلك ، الخلفية من صفائف غير المعرب عنها الحد الأدنى جدا. وعلاوة علي ذلك ، ميكروصفائف المطبوعة مع بولي يسين هي استنساخه وعرض مستويات جيده من البروتينات (الشكل 2).
وكان التعديل الحاسم التالي الذي اجري علي فحص نابا القياسية أضافه خطوه العلاج الفوسفاتيز/DNase. العلاج من ميكروصفائف مع الفوسفاتيز يسمح بازاله اي فوسفولات التي وقعت في مزيج IVTT اثناء تخليق البروتين والقبض (الشكل 3). مصدر هذا فوسفولات يمكن ان يكون من النشاط اوتوفوسفروسيليشن الذاتية أو من نشاط كيناسيس الموجودة في مزيج IVTT. وقد سمح أزاله جميع الفوسفات بعد التعبير بسهوله التعرف علي الانزيمات النشطة والتي يمكن الخضوع لها (الشكل 3).
الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول نابا هي تقنيه قويه ، ولكن كما هو متوقع ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة. الأول هو الحصول علي الحمض النووي عاليه الجودة في التركيز المناسب. استخدام الحمض النووي من نوعيه رديئه أو في تركيزات منخفضه سوف تولد ميكروصفائف نوعيه رديئه مع العديد من الميزات التي لا يتم التعبير عنها وعرضها في المستويات المناسبة ، وخفض عدد البروتينات تحليلها علي الصفيف. الخطوة الحاسمة الثانية هي التعبير عن البروتينات علي ميكروصفيف. استخدام نظام IVTT التي من شانها ان تعبر عن مستويات عاليه من البروتين الوظيفي أمر حيوي لدراسة نشاط كيناز علي الصفيف.
والخطوة الحاسمة التالية في فحص TKI هي كيفيه معالجه المصفوفات المجهرية. يجب ان لا تجف ميكروصفائف اثناء اي خطوه من البروتوكول ، وينصح التعامل مع لطيف لمنع الخدوش التي يمكن ان تزيد من اشاره الخلفية. نظرا لان صفائف من التجربة بأكملها ستقارن ضد بعضها البعض ، فمن المهم ان أؤكد ان كل خطوه الحضانة حتى عبر جميع الشرائح. علي سبيل المثال ، الوقت المطلوب لتنفيذ خطوه واحده في صفيف واحد يجب ان يؤخذ في الاعتبار عند معالجه دفعه من 20 صفائف لمنع الاختلافات في طول الحضانة عبر الصفائف.
وأخيرا ، فان تصميم التجربة وادراج كل من الضوابط الايجابيه والسلبية أمران بالغا الاهميه لمراقبه الجودة وتحليل البيانات. المجموعة الاولي من عناصر التحكم هي تلك التي تطبع في كل صفيف وتشمل الضوابط السلبية [اي ، البقع الفارغة (دون اي ماده مطبوعه) ، الماء أو ناقل فارغ (التعبير عن العلامة فقط)] ، فضلا عن السيطرة الايجابيه (اي ، مفتش المنقي ، التي يتم الكشف عنها من قبل الأجسام المضادة الثانوية وخاملة للتغيير في مستويات فوسفولات). بشكل جماعي ، فانها تقيس مستويات الخلفية من ميكروصفيف ، يمكن ترحيلها اثناء الطباعة وكثافة اشاره من طريقه الكشف.
والمجموعة التالية من عناصر التحكم هي ضوابط فحص المخدرات وتشمل المصفوفات المجهرية الفوسفاتية والفوسفروكسيلاتيد (في وجود أو غياب DMSO). وكما ذكر في وقت سابق ، يقيس ميكروصفيف ديفوسفوريلاتيد مستوي الفوسفاريليشن بعد العلاج الفوسفاتيز التالي مستوي خط الأساس لجميع التجارب الأخرى. ال [لوور] الخط أساسي مستوي, ال [هيغر] المدى حركيه من الاختبارات. المصفوفات التلقائية التي تقدم الحد الأقصى لمستويات فوسفولات من جميع صفائف ويجب ان تكون الاشاره قويه وواضحة. يتم استخدامه لتحليل البيانات ، ولكن أيضا كعنصر تحكم ان يتم تنفيذ كافة ردود الفعل بنجاح علي الصفيف.
قيود التقنية اعتبارا من الآن ، واحده من القيود المفروضة علي الكشف عن المخدرات المعروضة هنا هو قدرته علي الشاشة فقط كيناسيس البروتين التي يمكن ان تكون اوتوفوسفوليلتيد. واحده من الطرق الممكنة للتغلب علي هذا هو طباعه كيناز والركيزة المعروفة في نفس المكان. وتم بنجاح إنجاز الطباعة المشتركة للحمضالنووي لاثنين من البروتينات المتميزة ، مما يوحي بجدوى هذا النهج. وعلاوة علي ذلك ، قد لا يتم طي البروتين المعروض علي الصفيف بشكل صحيح مما يؤدي إلى وجود بروتين غير نشط. وقد حقق استخدام نظام التعبير القائم علي الإنسان تحسنا كبيرا في نشاط كيناز مقيسا بالمصفوفة ؛ ومع ذلك ، لا يزال لا يمكن تحليل بعض البروتينات علي الصفيف بسبب عدم نشاطها.
والقيد الثاني هو قياس الفوسفات باستخدام الأجسام المضادة لعموم فوسفس-صور. وعلي الرغم من عدم الخصوصية المتعلقة بالفكرة الخاصة بموقع الفوفوفورلات ، فقد حدثت جميع فوسفولات القياس علي بقايا تيروزين ، تاركه وراءها المصليين والثلاثات والانزيمات الخاصة بهم. حتى الآن ، تم اختبار أكثر من 10 الأجسام المضادة لعموم الفوسفاو-سر/Thr دون نجاح ، علي الرغم من عده محاولات لتحسين الحضانة وظروف الغسيل. نظام الكشف الجديد الذي هو مستقل عن الأجسام المضادة قد يكون الخيار الأفضل لتوسيع عدد البروتينات التي يمكن فحصها لتثبيط المخدرات. في هذا السياق ، تتوفر بعض الخيارات بما في ذلك النشاط الإشعاعي أو النهج الكيميائية مثل الاقتران بالنقر. وهناك حاجه إلى سلسله من التحسينات للتقليل من اشاره الخلفية وتوفير مجموعه ديناميكية جيده لمقايسات.
القيد الثالث هو الحصول علي استنساخ cDNA ليتم طباعتها علي الصفيف. يمكن إنشاء استنساخ cDNA باستخدام اي تقنيه الاستنساخ بما في ذلك أنظمه أعاده التركيب الخاصة بالموقع ، مثل منشئ أو بوابه23. خيار آخر هو شراء المستنسخين من مكتبه دناس ، وجدت في < https://Dnasu.cor/dnasu/hom.do > ، حيث أكثر من 17,000 cDNAs المستنسخة ، بما في ذلك kinome البشرية بأكملها ، متاحه بسهوله لاستخدامها لبناء نابا صفائف24 .
والقيد الرابع هو انه ليس كل مختبر مجهز بالمعدات المناسبة لتلفيق وفرز صفائف نابا الخاصة بهم. يوفر هذا البروتوكول أساليب بديله لتوليد الحمض النووي للطباعة علي ميكروصفيف ، دون الحاجة إلى معدات عاليه الانتاجيه ، وبروتوكولات لتنفيذ جميع الخطوات التهجين يدويا. ومع ذلك ، لا يزال من الضروري الوصول إلى ماسح ضوئي و ميكروصفيف. أحد الخيارات للتغلب علي هذه المشكلة هو استخدام خدمه ومرفق نابا الاساسيه ، وجدت في < http://nappaproteinarray.org/> ، والتي توزع ميكروصفائف نابا مخصصه بسعر الاكاديميه غير الربحية. وأخيرا ، واعتبارا من اي منهجيه للفحص ، فان البيانات التي يتم الحصول عليها علي صفائف تكون عرضه لان تكون تحفا (اما ايجابيه أو سلبيه) التالي ينبغي التحقق من صحتها باستخدام المقايسات المتعامدة.
الاهميه فيما يتعلق بالأساليب القائمة العديد من منصات متاحه تجاريا للكشف عن كيناسيس البروتين. نهج واحد يستخدم بشكل روتيني هو اختبارات ملزمه ، والتي يمكن ان تؤدي مع شظايا البروتين ، والمجال كيناز ، وشظايا البروتين أكبر مع المجال كيناز وبعض المناطق التنظيمية ، وحتى البروتينات كامله الطول. وعاده ما يتم التعبير عن البروتينات في النظم البكتيرية بسبب التكلفة والبساطة في بروتوكولات التعبير وتنقيه. ثم يتم قياس التفاعل بين الدواء من الفائدة والبروتين مع نوع من الفحص التقرير مثل مضان أو وجود العلامات ، علي سبيل المثال. القيد الرئيسي لهذه المجموعة من النهج هو حقيقة ان البروتين ليس بالضرورة نشطه اثناء التفاعل مع المخدرات ، والتي قد تؤدي إلى تحديد التفاعلات السلبية الايجابيه والزائفة كاذبه. شظايا البروتين هي عرضه بشكل خاص للتغيرات في التكوين وعدم وجود النشاط وجميع البيانات التي تم الحصول عليها ينبغي التحقق من صحتها باستخدام البروتينات النشطة ، ويفضل في شكلها كامل طول. وهناك قيد آخر علي بعض المنصات هو القدرة علي الشاشة فقط النظير ATP ، والحد من استخدامها الشامل.
معظم الخدمات المتاحة تجاريا لفحص TKIs باستخدام النهج الانزيميه القائمة تستخدم فقط الإصدارات من نوع البرية من كيناز الفائدة ، وأحيانا فقط عدد قليل مختاره من المسوخ. مع العلم ان مقاومه المخدرات شائعه جدا في المرضي الذين يتعاملون مع TKI ، من المهم ان تكون قادره علي قياس الاستجابة للمخدرات في المسوخ مختلفه ، لاختيار المثبط الأكثر ملاءمة. نظرا لطبيعة نابا ، وفحص المسوخ كيناز بسيطه ويمكن إنجازها بسهوله ، والاداه المطلوبة الوحيدة هي دمج متحولة كيناز في مجموعه نابا cDNA ، والتي يمكن القيام به عن طريق الطفرات الخاصة بالموقع ، علي سبيل المثال.
التطبيقات المستقبلية واحده من الاشكال الأكثر شيوعا من العلاج الذي ينقضي في العلاج بالسرطان باستخدام مثبطات كيناز هو اكتساب الطفرات في الهدف المخدرات خلال دوره العلاج. فحص هذه المسوخ بشان استجابتها لمثبطات كيناز له اهميه حيوية لاختيار الجيل الثاني/الثالث من TKIs لتحقيق العلاج الشخصي لكل مريض. نهج الكشف عن المخدرات المعروضة هنا, يوفر منصة الفرز غير متحيزة التي يمكن اختبار اي مثبطات كيناز التيروزين ضد لوحه من الكيناسيس تيروزين الموجودة في الجينوم البشري. منذ يتم التعبير عن البروتينات المعروضة علي صفائف نابا في المختبر من cDNA المطبوعة علي الشريحة ، اي متغير متحولة يمكن بسهوله ان تدمج في مجموعه cDNA ليتم عرضها علي الصفيف. المنشاة التي يمكن توليد المسوخ كيناز والتعبير عنها علي الصفيف ، جنبا إلى جنب مع قوه عاليه الانتاجيه من تقنيه نابا ، يوفر بيئة فريدة من نوعها لدراسة المسوخ كيناز واستجابتهم للمخدرات ، مما يجعل نابا مناسبه فحص المخدرات شخصيه ، واحده من أهداف الطب الدقة.

كيناسيس البروتين هي المسؤولة عن فوسفولات من أهدافها ، ويمكن ان تعدل المسارات الجزيئية المعقدة التي تتحكم في العديد من الوظائف الخلوية (اي انتشار الخلايا ، والتمايز ، وموت الخلايا والبقاء علي قيد الحياة). ويرتبط تحرير نشاط كيناز مع أكثر من 400 الامراض ، مما يجعل مثبطات كيناز واحده من الفئات الرئيسية من الادويه المتاحة لعلاج العديد من الامراض ، بما في ذلك السرطان والقلب والاوعيه الدموية والاضطرابات العصبية وكذلك التهابات وامراض المناعة الذاتية1،2،3.
مع ظهور الطب الدقيق ، وتحديد العلاجات الجديدة ، وخاصه مثبطات كيناز ، لديها نداء كبير صيدليا وسريريا. ويمكن استخدام العديد من النهج لتحديد أزواج جديده ممكنة من مثبطات كيناز/كيناز ، بما في ذلك تصميم دي نوفو من مثبطات كيناز وتحديد أهداف جديده للادويه القائمة المعتمدة من قبل هيئه الاغذيه والعقاقير. هذه الاخيره جذابة بشكل خاص ، حيث ان الوقت والمال اللازم لتنفيذ هذه الادويه في العيادات تنخفض بشكل كبير بسبب توافر بيانات التجارب السريرية السابقة. والمثال المتعارف عليه لأعاده الغرض من مثبطات كيناز هو imatinib ، المصممة في البداية لعلاج ابيضاض الدم النقوي المزمن (CML) من خلال تثبيط BCR-Abl ، والتي يمكن أيضا ان تستخدم بنجاح لعلاج الإفراط في التعبير c-كيت أورام الأمعاء اللحمية (العلماء)4،5،6،7.
يمكن اجراء فحص مثبطات كيناز في اختبارات ملزمه أو المقايسات القائمة علي الانزيميه. تركز الدرجة الاولي من المقايسات علي تفاعلات البروتين والدواء ويمكن ان توفر معلومات مثل موقع الربط والتقارب. منذ نشاط كيناز في وقت هذه الاختبارات غير معروف ، يمكن تفويتها عدد من التفاعلات أو تحديدها زورا بسبب التغيرات المطابقة في البروتين. ومن ناحية أخرى ، تتطلب المقايسات القائمة علي الانزيميه ان تكون البروتينات البروتينية نشطه وتوفر معلومات قيمه فيما يتعلق بتاثير المثبط علي نشاط الانزيم ، ومع ذلك ، فان هذا النوع من الفحص هو عموما أكثر استهلاكا للوقت ومكلفا. حاليا ، كلا النوعين من المقايسات متاحه تجاريا من عده مصادر. انها تمثل خيارا موثوقا للكشف عن مثبطات كيناز مع بعض القيود, بما في ذلك: I) معظم الطرق تنطوي علي اختبار الانزيمات المتعددة بشكل فردي, التي يمكن ان تجعل من فحص مجموعه كبيره من البروتينات مكلفه; II) تقتصر مجموعه من الانزيمات التي سيتم اختبارها علي قائمه من النوع الذي تم اختياره مسبقا ، والأنواع البرية ، والعديد من الإصدارات المتحولة المعروفة لبعض الانزيمات ، مما يعوق اختبار العديد من الاشكال الجديدة المتحولة.
وفي هذا السياق ، فان ميكروصفائف البروتين هي منصة قويه قادره علي التغلب علي بعض القيود التي تقدمها التقنيات المتاحة تجاريا. وهي مناسبه لاجراء اختبارات الانزيميه في الفحص عاليه الانتاجيه باستخدام كامل الطول ، والبروتينات النشطة من اي تسلسل الفائدة. يمكن ان تتولد ميكروصفائف من قبل نهج تجميعها ذاتيا مثل نابا (الحمض النووي مصفوفة بروتين قابل للبرمجة) ، والتي يتم التعبير عن البروتينات في الوقت المناسب لاختبارات ، مما يزيد من احتمال ان تلك المعروضة علي الصفيف هي في الواقع نشطه. يتم إنتاج البروتينات المعروضة علي نابا باستخدام التماثيل البشرية المشتقة والبروتينات المرافقة من أجل تحسين احتمال الطي الطبيعي والنشاط.
يتم برمجه البروتينات في البداية عن طريق الطباعة cdnas الترميز للجينات من الفائدة تنصهر مع علامة التقاط ، مع وكيل القبض ، علي سطح ميكرواري. ثم يتم إنتاج البروتينات علي ميكروصفائف باستخدام نظام النسخ والترجمة في المختبر (ivtt) ، ويتم تعبئة البروتينات المعرب عنها حديثا علي سطح ميكروارس من قبل وكيل القبض. ويمكن استخدام صفائف نابا المعرب عنها لدراسة البروتينات المعروضة علي الصفيف بطريقه غير متحيزة ، عاليه الانتاجيه8،9.
سابقا ، تبين ان البروتينات المعروضة علي صفائف نابا مطوية بشكل صحيح للتفاعل مع الشركاء المعروفين10؛ وعلاوة علي ذلك, تم استغلال النشاط الانزيمي لأول مره في 2018, عندما تبين ان البروتين كيناسيس عرض علي ميكروصفيف اوتوفوسفروفات11. حتى الآن ، تم استخدام منهجيه نابا للعديد من التطبيقات المتميزة ، بما في ذلك اكتشاف المؤشرات البيولوجية12،13،14،15،16،17، البروتين البروتين التفاعلات10،18، الركيزة تحديد19، وفحص المخدرات11. وتعد مرونته أحدي الخصائص الرئيسية للمنبر التي تسمح بالتكيف مع كل تطبيق.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص مثبطات التيروزين كيناز في صفائف نابا تجميعها ذاتيا. تم تحسين المنصة لعرض البروتين البشري النشط ولتحليل نشاط بروتين كيناز ، مع خلفيه منخفضه ونطاق ديناميكي عالي. ومن بين التعديلات التي تم تنفيذها لاستخدام نابا لفحص مثبطات كيناز ما يلي: انا) التغييرات في كيمياء الطباعة ، II) دي فوسفوريلاتيون من البروتين ميكروصفيف قبل فحص مثبطات كيناز ، و III) الأمثل للكشف عن البروتينات الفوسفوليه علي الصفيف. هذا البروتوكول هو الأول من نوعه ويوفر معلومات فريدة عن دراسة كيناز في ميكروصفائف نابا.

<table><tbody><tr><td><قوي > كاشف / مادة < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>364 ألواح بئر (للصفيف)</td> <td>Genetix</td><td>x7020</td><td></td></tr><tr><td>800 & micro ؛ لوحة تجميع L 96 جيدا</td><td>Abgene</td><td>AB-0859</td><td></td></tr><tr><td>جهاز 96 دبوس</td><td>Boekel</td><td>140500</td><td></td></tr><tr><td>حمض الخليك</td><td>Millipore-Sigma</td><td>1.00066</td><td></td></tr><tr><td>الأسيتون 99.9٪</td> <td>Millipore Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>ختم الألومنيوم ل 96 لوحة بئر VWR</td><td></td><td>76004-236</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td> <td>بيرس</td><td>80370</td><td></td></tr><tr><td>الجسم المضاد للعلم M2 المنتج في الفأر</td><td>Millipore Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة للأرانب المضادة للعلم (متعددة النسيلة)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>إشارات الخلية</td><td>9804S</td><td></td></tr> <tr><td>& beta - هيدرات ملح ثنائي الصوديوم Glycerophosphate</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>أجار البكتريولوجية</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td></td></tr><tr><td>حجب العازلة</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>37535</td><td></td></tr><tr><td>Brij 35</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>BP345-500</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td> <td>ThermoFisher / Pierce</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>BSA (زلالات مصل الأبقار)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip 24 × 60 مم</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey المضاد للفأر IgG (H + L) Jackson</td> <td>ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>DeepWell Block ، حالة 50</td><td>ThermoFisher / AbGene</td><td>AB-0661</td><td></td></tr><tr><td>DEPC المياه</td><td>Ambion</td><td>9906</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>صبغة إقحام الحمض</td> النووي <td>Invitrogen</td><td>P11495</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Millipore-Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول 200 دليل</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>لوحات الترشيح</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA77002804</td><td></td></tr><tr><td>الأختام المنفذة للغاز ، صندوق يحتوي على 50</td><td>ThermoFisher / AbGene</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>صندوق زجاجي</td><td>ويتون</td><td>900201</td><td></td></tr><tr><td>شرائح زجاجية</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>جلسرين</td><td>ميليبور سيجما</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Millipore-Sigma</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>نظام IVTT القائم على الإنسان</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoPure Mouse IgG جزيء كامل</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>31202</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>KCl (كلوريد البوتاسيوم)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4(فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>إشارات خلية عازلة كيناز</td><td></td><td>9802</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (أسيتات البوتاسيوم)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>P1190</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Protein Phosphatase</td><td>New England biolabs</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>Lifterslips ، 24 × 60 مم</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25X60I24789001LS</td><td></td></tr><tr><td>رف معدني 30 منزلقا بدون مقابض</td><td>Wheaton</td><td>900234</td><td></td></tr><tr><td>MgCL2 (كلوريد المغنيسيوم)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (أورثوفانادات الصوديوم)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc (أسيتات الصوديوم)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (هيدروكسيد الصوديوم)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.10 / 740414.10</td><td></td></tr><tr><td>Nucleoprep Anion II</td><td>Macherey Nagel</td><td>740503.1</td><td></td></tr><tr><td>حمض الفوسفوريك</td><td>Millipore-Sigma</td><td>79617</td><td></td></tr><tr><td>محلول بولي إل ليسين (0.01٪)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>A-005-C</td><td></td></tr><tr><td>بروتين فوسفاتيز (لامدا)</td><td>نيو إنجلاند بيولابز</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>حشية الختم</td><td>Grace Bio-Labs، Inc</td><td>44904</td><td></td></tr><tr><td>عبوات السيليكا</td><td>VWR</td><td>100489-246</td><td></td></tr><tr><td>صفيحة بئر واحدة</td><td>ThermoFisher / Nalge Nunc</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات الصوديوم (3M ، درجة الحموضة 5.5)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>تيرابايت وسائط (مرق رائع)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T0918</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>مستخلص الخميرة</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Catalog number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td>Maker/ نموذج< / قوي></td><td></td><td></td></tr><tr><td>حاضنة تقشعر لها الأبدان قابلة للبرمجة</td><td>حاضنة توري باينز IN30 مع شاكر تبريد</td><td></td><td></td></tr><tr><td>لنمو البكتيريا</td> شاكر <td></td><td></td><td>ATR Multitron</td></tr><tr><td>مشعب فراغ مع مصيدة النفايات السائلة</td><td>MultiScreenVacuum Manifold 96 بئر</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 بئر autopippetor / معالج سائل</td><td>Genmate أو Biomek FX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>موزع السوائل</td><td>Wellmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA microarray</td><td>Genetix QArray2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>محطة التهجين الأوتوماتيكية</td><td>Tecan HS4800 Pro محطة</td><td></td><td></td>التهجين</tr><tr><td>Microarray الماسح الضوئي</td><td>Tecan PowerScanner</td><td></td><td></td></tr> Microarray <tr><td>قياس البيانات</td><td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

فحص مثبطات كيناز أمر حاسم لتحسين فهم خصائص المخدرات وتحديد الأهداف المحتملة الجديدة مع الآثار السريرية. وتم الإبلاغ عن عده منهجيات لإنجاز هذا الفحص. ومع ذلك ، كل له القيود الخاصة به (علي سبيل المثال ، فحص نظائرها ATP فقط ، وتقييد استخدام المجالات المنقية كيناز ، والتكاليف الكبيرة المرتبطة باختبار أكثر من عدد قليل من تحركات في وقت واحد ، وعدم وجود مرونة في فحص البروتين تحركات مع طفرات جديده). هنا ، يتم عرض بروتوكول جديد يتغلب علي بعض من هذه القيود ويمكن استخدامها لفحص غير متحيز لمثبطات كيناز. قوه هذه الطريقة هي قدرتها علي مقارنه نشاط مثبطات كيناز عبر العديد من البروتينات ، اما بين الانزيمات المختلفة أو المتغيرات المختلفة لنفس كيناز. وتستخدم المصفوفات المجهرية للبروتين التي يتم تجميعها ذاتيا والمتولدة من خلال التعبير عن البروتينات التي يقوم بها نظام النسخ والترجمة القائم علي الإنسان في المختبر (IVTT). البروتينات المعروضة علي ميكرواري نشطه ، مما يسمح لقياس اثار مثبطات كيناز. يصف الاجراء التالي خطوات البروتوكول بالتفصيل ، من توليد ميكروصفيف والفرز إلى تحليل البيانات.

الذاتي تجميعها نابا ميكروصفائف توفر منصة صلبه التي يمكن استخدامها للعديد من التطبيقات المتميزة ، بما في ذلك اكتشاف المؤشرات الحيوية ، والتفاعلات بروتين البروتين ، وتحديد الركيزة ، وفحص المخدرات10،11 ،12،13،14،15،16،17،18،19،20.
يتم تمثيل المنهجية الشاملة المعتمدة لدراسة نشاط كيناز وفحص مثبطات كيناسيس تيروزين علي ميكروصفائف نابا في الشكل 1. أولا ، يتم إنشاء ميكروصفائف نابا بواسطة التجميد من cDNA والقبض علي عامل علي ميكروصفائف المغلفة. ثم يتم استخدام cDNAs كقالب للنسخ والترجمة من البروتينات ، وذلك باستخدام نظام IVTT القائم علي الإنسان ، والبروتينات التي تم توليفها حديثا يتم تعبئتها من قبل وكيل القبض9. ويمكن رصد نوعيه ميكروصفيف المطبوعة عن طريق قياس مستويات الحمض النووي (تاكيد الطباعة متسقة) أو البروتين المعروضة علي الصفيف (تاكيد التعبير البروتين والقبض; الشكل 1). لإنقاص اشاره الخلفية وزيادة النطاق الديناميكي للتجربة ، يتم التعامل مع ميكروصفائف مع 1) لأمدا الفوسفاتيز لأزاله فوسفوريلاتيون من السير/Thr/صور بقايا ، ثم مع 2) DNase لتبسيط الكيمياء علي الفور وانخفاض خلفيه (الشكل 1).
الخطوة التالية هي رد فعل الفوسفات الألى ، حيث يتم احتضان ميكروصفائف مع العازلة كيناز في غياب ATP (صفيف التحكم السلبية ، المشار اليها باسم ميكروصفائف ديفوسفوريلاتيد) ، ويتم تكمله العازلة كيناز مع ATP (السيطرة الايجابيه ، يشار اليها باسم صفائف اوتوفوسفريلاتيد) أو ATP + DMSO (مراقبه المركبات). وينبغي التاكيد علي انه خلال هذه الخطوة ، لا يتم أضافه كيناز ؛ ولذلك ، يتم تحديد النشاط الجوهري لكل كيناز المعروضة علي ميكرواري من خلال قياس مستويات الفوسفات الخاصة به باستخدام الأجسام المضادة لعموم مكافحه الفوسفس-التيروسين متبوعا الأجسام المضادة الثانوية cy3-labbeled (الشكل 1).
ويظهر في الشكل 2مراقبه جوده صفائف نابا-كيناز التي تعرض لوحه من البروتينات البشرية المطبوعة في بيلوروسي. وتم قياس مستويات الحمض النووي غير المعبا بواسطة تلطيخ الحمض النووي وأظهرت اشاره حتى عبر ميكروصفيف ، مما يوحي بان كميه الحمض النووي المطبوع علي الصفيف كانت موحده. ومن الممكن أيضا لمراقبه العديد من الميزات دون اي تلطيخ الحمض النووي. هذه الميزات تتوافق مع بعض الضوابط التي تم حذف الحمض النووي من مزيج الطباعة [اي ، البقع الفارغة (لا شيء تم طباعته) ، بقع المياه ، وتنقيه بقعه مفتش (بولي-يسين ، crosslinker والمنقي مفتش) ، مزيج الطباعة فقط (مزيج الطباعة كامله: بولي-يسين بالاضافه إلى الأضداد ومكافحه العلم الأجسام المضادة ، من دون اي الحمض النووي)]. وقد تم تقييم مستويات البروتين المعروضة علي ميكروصفائف نابا كيناز بعد رد فعل IVTT باستخدام مضاد لعلامات الجسم.
بالنسبة للفحص كيناز ، تم استخدام العلم كعلامة الاختيار وتم قياس مستوي البروتين المعروض علي ميكرواري باستخدام الأجسام المضادة للعلم. كما هو مبين ، فان غالبيه البقع التي تحتوي علي cDNA عرضت بنجاح مستويات قابله للكشف من البروتين. بعض البقع السيطرة دون cDNA كشفت أيضا اشاره مع الأجسام المضادة للعلم: بقعه مفتش (تستخدم للكشف عن نشاط الأجسام المضادة الثانوية) والبقع ناقلات فارغه (رموز cDNA للعلامة فقط) (الشكل 2). وأظهرت مصفوفات نابا كيناز استنساخ جيده بين الشرائح ، مع ارتباط مستويات عرض البروتين بين دفعات الطباعة متميزة اعلي من 0.88 (الشكل 2). في نفس الدفعة كان الارتباط اعلي حتى ، بالقرب من 0.92 (لا تظهر البيانات).
بعد ذلك ، تم قياس النشاط كيناز اوتوفوسفوليلاتيون من البروتينات المعروضة علي الصفيف باستخدام المضادة-فوسفس-التيروزين الأضداد (الشكل 3). أظهرت البروتينات المعروضة علي الصفيف مستويات عاليه من فوسفولات البروتين بعد التعبير (الشكل 3، يسار) ، والتي قد تكون ناجمه عن نشاط كيناز الذاتية من البروتين المعروض علي الصفيف أو بواسطة تحركات النشطة الموجودة في مزيج ivtt. وقد تمت أزاله هذا الفوسفات تماما مع العلاج الفوسفاتيز لأمدا واستخدمت هذه المصفوفات المجهرية لاختبارات كيناز. بعد الفوسفات ، وأظهرت ردود الفعل اوتوفوسفرويليشن دون ATP اي مستويات كبيره من فوسفوريلاتيون ، كما هو متوقع ، في حين أظهرت ميكروصفائف المحتضنة مع العازلة كيناز في وجود ATP فوسفات البروتين بسرعة 15 دقيقه ( الشكل 3). بالنسبة للكشف عن المخدرات ، تم قياس نشاط كيناز بعد 60 دقيقه من رد الفعل الألى لتعظيم عدد تحركات اختبارها.
وأظهرت المقارنة بين المصفوفات المجهرية التي تم فيها قياس مستويات الفوسفات الحق بعد التعبير عن البروتين (الشكل 3، اليسار) وبعد 60 دقيقه من رد الفعل الألى (الشكل 3، الحق): ط) البروتينات الفوسفارلاتيد فقط بعد التعبير ، مما يوحي بأنها يمكن ان تكون exogenylated بواسطة البروتينات الموجودة علي مزيج IVTT ، ولكن لا يمكن ان يكون اوتوفوسفريلاتيد. ' 2 ' فوسفات البروتين فقط بعد رد فعل الفوسفات الذاتي ، مما يوحي بان هذه البروتينات لم تكن نشطه بعد التعبير عن البروتين والعوامل المشتركة المطلوبة الموجودة في العازلة كيناز لتكون نشطه ؛ أو iii) فوسفات البروتين علي كلا صفائف ، مما يوحي بأنها كانت نشطه في كلا الإعدادين (الشكل 3).
كمثال علي النتائج التي تم الحصول عليها لفحص مثبطات التيروزين كيناز علي مصفوفات نابا كيناز ثلاثه مثبطات كيناسيس مع انتقائية متميزة عبر البروتين واستخدمت كيناسيس: ستوروبورنين ، imatinib و إيبروتينيب. بالنسبة لجميع العروض ، تم احتضان المصفوفات المجهرية الخاصة بالفوسفات مع زيادة تركيزات TKI (بدءا من 100 نانومتر إلى 10 ام) اثناء رد الفعل الألى. اختبار tki الأول كان ستوروبورنين ، مثبط بروتين كيناز العالمية ، التي أظهرت تثبيط كيناز قويه علي ميكروصفيف عبر تقريبا جميع تحركات اختبار11.
بعد ذلك ، تم اختبار imatinib ، وهو مثبط abl و c-كيت تستخدم لعلاج ابيضاض الدم النقوي المزمن والأورام المعدية المعوية4،5،6،7. علي نابا كيناز صفائف imatinib أظهرت انخفاضا كبيرا في النشاط Abl1 و bcr-Abl1 في حين بقيت تحركات الأخرى في الغالب غير متاثر (الشكل 4a). تم تطبيع البيانات الكمية للنشاط كيناز ضد صفيف ديفوسفوفورلات وتمثل كنسبه مئوية من ميكروصفيف السيطرة الايجابيه (السيارة فقط). وترد البيانات المتعلقة TNK2 (كيناز غير ذات الصلة) و Abl1 و BCR-Abl1 في الشكل 4 باء. كما هو متوقع ، أظهرت imatinib تثبيط انتقائي نحو Abl1 و BCR-ABl1. كانت البيانات الخاصة ب c-Kit غير حاسمه بسبب عدم وجود نشاط علي صفائف التحكم الموجبة.
وأخيرا ، تم اختبار إيبروتينيب ، وهو مثبط التكافؤ الذي وافقت عليه الهيئة لشركه بروتون التيروزين كيناز (BTK). ويستخدم حاليا إيبروتينيب في علاج العديد من السرطانات المرتبطة بالدم مع فرط نشاط btk, بما في ذلك سرطان البول اللمفاوي المزمن (cll), الغدد الليمفاوية الخلية عباءة, والدنستروميميد ماكروجلوكولونوميا21,22. الشكل 4C، هو ممثل للنتائج النموذجية التي تم الحصول عليها للفحص الإيبروتينيب. يتم عرض نشاط كيناز ABL1 (غير ذات الصلة كيناز) و BTK (الهدف المتعارف عليه) و ERBB4 (الهدف الجديد المحتمل) في الشكل 4D. وتشير البيانات ERBB4 يمكن ان تثبطها إيبروتينيب بطريقه محدده الجرعة. تم تاكيد هذا التثبيط في المختبر وفي الاختبارات المستندة إلى الخلايا11، مما يدل علي قوه هذه المنصة.
وتشير البيانات الماخوذه معا إلى انه يمكن استخدام منصة نابا-كيناز المجهرية للكشف غير المتحيز عن مثبطات المعارف التقليدية. وعلاوة علي ذلك ، فان الفرز هو سريع ويمكن تخصيصها بسهوله لتشمل اي اختلاف في البروتين الفوائد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> الشكل 1: التمثيل التخطيطي لمراقبه الجودة وفحص مثبطات التيروزين كيناز في صفائف نابا. يتم طباعه صفائف نابا مع الترميز cDNA للبروتين من الفائدة تنصهر مع علامة والأجسام المضادة القبض. خلال النسخ في المختبر ورد فعل الترجمة (ivtt) يتم التقاط البروتينات توليفها علي سطح ميكرواري من خلال العلامة من قبل الأجسام المضادة القبض. يتم تنفيذ مراقبه الجودة (QC) من صفائف عن طريق قياس مستويات الحمض النووي المطبوعة علي الشريحة ، وذلك باستخدام صبغه النيون الحمض النووي-intercalating ، ومستويات البروتين المعروضة علي الصفيف باستخدام الأجسام المضادة علامة محدده. للفحص كيناز ، يتم التعامل مع ميكروصفائف مع DNase و الفوسفاتيز ، بعد رد فعل IVTT ، لأزاله الحمض النووي المطبوع وجميع فوسفولات التي قد تكون وقعت اثناء تخليق البروتين. صفائف ديفوسفولولاتيد جاهزه الآن لاستخدامها في الشاشة المخدرات. بالنسبة لكل فحص ، يتم استخدام ثلاث مجموعات من الضوابط بشكل روتيني: (I) صفائف الفوسفات ، حيث يتم تنفيذ رد الفعل الألى بدون ATP ؛ ' 2 ' المصفوفات المجهرية الفوسفاتية التلقائية ، التي يتم فيها رد فعل الفوسفات الألى في وجود ATP ؛ و (III) مجموعه المعالجة DMSO (المركبة) ، حيث يتم تنفيذ تفاعل اوتوفوسفات الألى مع ATP و DMSO. الشرائح المعالجة بتركيز مختلف من مثبطات كيناز تتبع نفس البروتوكول المستخدم لصفائف المعالجة DMSO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> الشكل 2: النتائج التمثيلية لمراقبه الجودة لمصفوفات نابا كيناز ذاتية التجميع. يتم عرض محتوي الحمض النووي الذي يقاس بصبغه الحمض النووي الفلورية البينية (اليسار) ومستويات البروتين المعروضة علي المصفوفة المجهرية التي تقاس بالأجسام المضادة للعلم (الوسط). علي الجانب الأيمن هو مؤامرة الارتباط من مستويات البروتين المعروضة علي اثنين من المصفوفات نابا كيناز المطبوعة في دفعات منفصلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> الشكل 3: النتائج التمثيلية لنشاط كيناز في صفائف نابا-كيناز. وقد استخدمت المصفوفات المجهرية التي تعرض انزيمات البروتين في بيلوروسي لدراسة نشاط بروتين كيناز علي الصفيف من خلال قياس فوسفولات البروتين باستخدام أضداد pTyr المضادة ، تليها الأجسام المضادة للماوس cy3 المسمية. التحكم صفائف دون العلاج الفوسفاتيز/DNase وبدون ATP خلال رد فعل الفوسفات الذاتي واستخدمت لقياس فوسفولات الخلفية بعد التعبير البروتين (ما بعد التعبير). تم التعامل مع الميكروصفائف المتبقية مع الفوسفاتيز/الحمض النووي ، وتم تنفيذ رد فعل الفوسفات الألى دون ATP (ديفوسفوريلاتيد ميكروصفيف ، والسيطرة السلبية) أو مع ATP (اوتوفوسفريلاتيد ميكروصفائف). بالنسبة للصفائف المجهرية التلقائية تم تنفيذ رد الفعل الألى لمده 15 دقيقه ، 30 دقيقه ، 45 دقيقه ، أو 60 دقيقه ، كما هو مبين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> الشكل 4: بيانات تمثيليه من الشاشة التيروزين كيناز علي صفائف نابا كيناز. (ا) تم احتضان الفوسفاتيز/dnase صفائف نابا كيناز في زيادة تركيزات imatinib اثناء رد فعل الفوسفات الذاتي وكان النشاط كيناز قياس مع مضاده فوسفس-صور الأضداد. (ب) القياس الكمي لنشاط كيناز الملاحظ علي مصفوفات نابا-كيناز المعرضة لل imatinib. تم تطبيع البيانات ضد اشاره صفائف التحكم السلبية (ديفوسفوفورلات) ويتم عرضها كنسبه مئوية من صفائف التحكم الايجابيه (رد الفعل التلقائية التي أجريت في وجود DMSO). وترد بيانات مماثله لفحص الإيبروتينيب (جيم ، دال). وقد عدل هذا الرقم من رؤوف وآخرون11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
الملف التكميلي 1. بروتوكول بديل لفحص مثبطات التيروزين كيناز في صفائف نابا باستخدام محطه التهجين الألى. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

يتم تقديم بروتوكول مفصل لتوليد ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا لفحص مثبطات كيناز.

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA هو منصة قوية البروتين microarray التي يمكن استخدامها لدراسة نشاط البروتين وظيفة بطريقة غير متحيزة عالية الإنتاجية. يتم إنتاج البروتينات المعروضة على NAPPA في نظام تعبير يستند إلى الإنسان باستخدام الريبوسومات المشتقة من الإنسان و المرافقين من أجل تحسين احتمال الطي الطبيعي والنشاط. إن استخدام صفائف NAPPA لفحص مثبطات كيناز يوفر منصة جديدة لاختبار الأدوية الجديدة وطفرات كيناز ذات الصلة سريرياً.يمكن استخدام ميكرورايز البروتين المتولد عن منهجية NAPPA للعديد من التطبيقات المتميزة ، بما في ذلك اكتشاف العلامات الحيوية ، والتفاعلات البروتينية والبروتينية ، وتحديد الركيزة ، وفحص الأدوية. تنفيذ خطوات مراقبة الجودة على طول الطريق. اختبر جودة إعداد الحمض النووي الخاص بك، وmicroarray الحمض النووي، وميكرة البروتين.إذا في أي خطوة الجودة ليست جيدة، مجرد البدء من جديد. إثبات الإجراء سيكون ليزا ميلر، فني في مختبري. لإعداد النمو البكتيري في المنزل عالية الإنتاجية الإعدادية المصغرة، أولا تلقيح البكتيريا في لوحة أوجر في شكل 96 جيدا، والسماح لها تنمو لمدة 16 ساعة.في اليوم التالي، تعبئة كل بئر من لوحة بئر عميق مع 1.5 ملليلتر من مرق متوسطة رائع، تستكمل مع أمبيسيلين مضاد. يعتمد الجسم المضاد على علامة التحديد على البلازميد. ثم تعقيم جهاز 96 دبوس مع 80٪ الإيثانول واللهب.استخدام جهاز 96 دبوس العقيمة لاختيار المستعمرات من لوحة أجار المحتضنة بين عشية وضحاها وغمرها في آبار لوحة البئر العميق لتطعيم الثقافة. غطي الكتلة بختم قابل للنفاذ للغاز وحضن على شاكر لمدة 22 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، ومن 300 إلى 800 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، بيليه الثقافات وإعادة تعليق الثقافات وفقا للمخطوطة.البكتيريا الLyse عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من محلول اثنين في كل بئر، وختم لوحة مع ختم الألومنيوم، وعكس خمس مرات. احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق بالضبط. لتحييد الحل، إضافة 200 ميكرولترات من الحل ثلاثة، وختم لوحة مع ختم الألومنيوم، وعكس خمس مرات.ثم، تدور لوحة في 3800 G، أربع درجات مئوية، لمدة 30 دقيقة لمسح lysate supernatant. لإعداد لوحات راتنج تبادل أنيون، أولا، مزيج الطين تبادل anion، وصب الطين في حوض زجاجي. كومة مرشح لوحات على رأس لوحة بئر عميقة لتكون بمثابة وعاء جمع النفايات.ثم، وذلك باستخدام لوحة واسعة نصائح P1000، مزيج الطين، ونقل 450 ميكرولترات من الطين في كل بئر من لوحات التصفية. الطرد المركزي والتخلص من تدفق من خلال. الآن، نقل suate supernatants إلى كومة من لوحة الراتنج وكتلة بئر عميق.تدور لوحات مكدسة لمدة خمس دقائق في 30 مرة G مع أبطأ زيادة سرعة وإهمال تدفق من خلال. لغسل العمود، إضافة 400 ميكرولترات من محلول N3 غسل العازلة إلى كل بئر. نقل لوحة الراتنج إلى فراغ متعددة لإزالة العازلة غسل.كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات ثم قم بإزالة أي عازل غسالة متبقية مع دوران لمدة خمس دقائق قصيرة في 30 مرة G.To الزفير من الحمض النووي ، ضع لوحة الراتنج على لوحة جمع 800 ميكرولتر نظيفة. إضافة 300 ميكرولترات من الحل N5 لكل بئر والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. ثم، تدور لوحات مكدسة لمدة خمس دقائق في 20 مرات G مع زيادة بطيئة تصل السرعة إلى 233 مرة G لمدة دقيقة واحدة.لوحات تخزين في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية قبل الاستخدام. أولاً، ضع الشرائح على رف وتغمر الشرائح في خزان زجاجي يحتوي على محلول طلاء مُكَوّن 2٪ من مُكَوّنَ الأمينوزيلين في الأسيتون. صخرة الشرائح لمدة 15 دقيقة.ثم شطف الشرائح في الأسيتون تليها شطف النهائي في الماء. بعد ذلك، قم بتجفيف الشرائح باستخدام الهواء المُضغط. تهب عليها من جميع الزوايا لمدة ثلاث دقائق تقريبا حتى يتم إزالة جميع قطرات الماء.خزّن الشرائح المغلفة في درجة حرارة الغرفة على رف معدني داخل صندوق مغلق بإحكام. الآن، المضي قدما لتسريع الحمض النووي كما هو موضح في المخطوطة. ثم، resuspend بيليه الحمض النووي في 20 ميكرولترات من الماء فائقة الخطورة ويهز في 1000 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين.لإعداد عينة الصفيف، إضافة 10 ميكرولترات من مزيج الطباعة الطازجة التي تحتوي على الأجسام المضادة، crosslinker، وبوليسليسين لكل عينة الحمض النووي. لوحات ختم مع رقائق الألومنيوم ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة في 1000 دورة في الدقيقة. تخزين لوحات بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في يوم الطباعة، دوامة لفترة وجيزة وتدور لوحات. نقل 28 ميكرولترات من كل عينة إلى لوحة 384 جيدا. ضع الشرائح المغلفة أمينوسيلين ولوحة 384 جيدا، على سطح السفينة المصفّح، وبدء برنامج الطباعة microarray.عند الانتهاء من الطباعة، تسمية microarrays. يمكن تخزين microarrays لعدة أشهر حتى استخدام مزيد من. لقياس مستويات الحمض النووي، ضع الشرائح في صندوق ماصة وحجبها بـ 50 ملليلتر من عازلة الحجب.احتضان الشرائح على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم، والتخلص من الحل وإضافة 20 ملليلتر من العازلة منع و 33 ميكرولترات من الحمض النووي الفلورية صبغة intercalating. احتضان لمدة 15 دقيقة مع الانفعالات.بعد الحضانة هو أكثر، شطف الشرائح بسرعة مع المياه النقية جدا وجافة مع الضغط على الهواء. الـ(ميكروراي) جاهزون للمسح الضوئي للتعبير عن microarrays، ومنع الشرائح كما هو مبين سابقا ومن ثم شطف لهم بالماء النقي جدا، وجافة مع الهواء المضغوط المصفاة.إرفاق طوقا ختم إلى كل شريحة. إضافة 130 ملليلتر من النسخ في المختبر ومزيج الترجمة على الشرائح، وتدليك بلطف الأختام الختم بحيث النسخ في المختبر ومزيج الترجمة ينتشر بها ويغطي المنطقة بأكملها من مجموعة دون أي فقاعات. تطبيق الأختام منفذ دائرية صغيرة على كلا المنفذين.احتضان لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية للتعبير البروتين، تليها 30 دقيقة في 15 درجة مئوية لشل البروتين الاستعلام. ثم، وإزالة طوقا، وغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل في 15 ملليلتر TBST مع الحليب، وكتلة في نفس الحل لمدة ساعة واحدة. للكشف عن البروتينات على مجموعة، وإزالة TBST مع الحليب، ووضع الشرائح على لوحة الشبكة، وتطبيق 600 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية، الماوس المضادة العلم، المخفف من واحد إلى مائتين، و 1X TBST تكملها 5٪ الحليب.احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. غسل الشرائح مع 50 ملليلتر من 1X تفت و 5٪ الحليب على شاكر هزاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من. كرر الإجراء الخاص بالجسم المضاد الثانوي.بعد الحضانة ساعة واحدة هو أكثر، وغسل الشرائح مع 1X TBST على شاكر هزاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من. ثم شطف الشرائح بسرعة مع الماء النقي جدا، وجافة باستخدام الهواء الضغط. الشرائح جاهزة للمسح الضوئي.لإجراء معالجة الفوشطات و DNase، قم بغسل ومنع الشرائح المعبّر عنها مع TBST المُكمّلة بنسبة 3٪ BSA كما هو موضح في المخطوطة. ثم، ضع الشرائح على لوحة الشبكة وتطبيق 200 ميكرولترات من محلول phosphatase DNase. ضع غطاء microarray على القمة لتجنب التبخر.احتضان في 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة و 30 دقيقة في الفرن. ثم، غسل الشرائح مع 1X تST و 0.2 كلوريد الصوديوم الضرس على شاكر هزاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من. لأداء العلاج من المخدرات والتفاعل كيناز، وضع الشرائح على لوحة الشبكة وتطبيق 200 ميكرولتررس من محلول كيناز المخدرات.ضع زلة غطاء على القمة لتجنب التبخر. احتضان لمدة ساعة واحدة في 30 درجة مئوية في الفرن. المفتاح إلى بيانات قابلة لإعادة إنتاج هو وقت الحضانة متسقة عبر الشرائح.هذا مهم بشكل خاص خلال رد فعل كيناز. يجب حساب الوقت المطلوب لمعالجة كل شريحة. بعد ذلك، غسل الشرائح مع 1X ت السلست و 0.2 كلوريد الصوديوم الضرس على شاكر هزاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من.تكرار الكشف عن البروتين باستخدام الأجسام المضادة الأولية فوسفيتيروسين الأجسام المضادة المخففة واحد إلى 100 في TBST، تستكمل مع 3٪ الألبومين المصل البقري. استخدام 1x TBST و 3٪ البوم مصل الأبقار لغسل بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وTBST لغسل بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية. غسل وتجفيف كما كان سابقا.للحصول على الصورة، قم بتحميل microarrays في مجلة حامل الشريحة. قم بتحميل المجلة في الماسح الضوئي الصغير. مسح جميع microarrays مع الإعدادات الأمثل وتذكر لتحويل مكاسب السيارات قبالة عند مقارنة الصور عبر التجارب.نقل الصور إلى برنامج القياس الكمي، ومحاذاة الشبكة مع البقع، وقياس كثافة الإشارة لكل ميزة على microarray. المضي قدما في التحليل الإحصائي. في هذه الدراسة، أظهرت microarray غالبية البقع التي تحتوي على الحمض النووي التكميلي عرض بنجاح مستويات يمكن الكشف عنها من البروتين.وأظهرت ناوبا كيناسي microarrays استنساخ جيدة بين الشرائح، مع ارتباط مستويات عرض البروتين بين دفعات الطباعة متميزة أعلى من 0.88. وأظهرت النتائج التمثيلية لنشاط كيناز في صفائف كيناز NAPPA مستويات عالية من فوسفوريل البروتين بعد التعبير. المقارنة بين microarrays التي تم قياس مستويات الفوسفوريل مباشرة بعد العلاج الفسحاتية، وبعد 60 دقيقة من رد فعل الفوسفور، يشير إلى وجود كينازات البروتين النشطة على مجموعة.على صفائف كيناز NAPPA، أظهرت imatinib انخفاضا كبيرا في النشاط ABL1 وBCR-ABL1، في حين أن كينازات أخرى ظلت في معظمها لم تتأثر. نشاط كيناز تطبيع ضد مجموعة dephosphorylated ويمثل كنسبة مئوية من microarray التحكم الإيجابي أظهرت تثبيط انتقائي من imatinib نحو ABL1 وBCR-ABL1. أظهرت النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها لفحص ibrutinib أن نشاط كيناز من Kinase ABL1 غير ذي الصلة لا يتأثر.BTK الكنسي الهدف، وERBB4 الهدف الجديد المحتمل، وأظهرت انخفاض النشاط في وجود ibrutinib. وتشير البيانات إلى أن ERBB4 يمكن أن تمنعه ibrutinib بطريقة خاصة بالجرعة. يعتمد نجاح فحوصات البروتين الجزئي إلى حد كبير على جودة microarray نفسها.يجب استخدام العديد من ميزات التحكم الإيجابية والسلبية للسماح بتحليل البيانات بشكل صحيح. اختبار NAPPA kinase هو منصة فحص ، وعلى هذا النحو ، يجب التحقق من صحة البيانات التي تم الحصول عليها في عمليات الفحص المتابعة ، والتي قد تشمل في المختبر كيناز المقايس ، أو مقايسات الخلايا القائمة. منذ بروتوكول لدينا يبدأ مع cDNA، أي طفرة كيناز أو الاختلاف يمكن دمجها بسهولة في microarray ودرس في الإنتاجية العالية.خلال إعداد الطين وألواح الراتنج تبادل أنيون، فمن المستحسن استخدام الأقنعة لمنع استنشاق ممكن من جزيئات الراتنج.

kinase-inhibitor-screening-in-self-assembled-human-protein-microarrays

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

في هذا الفيديو ، نوضح الاختبار المتجانس المتجانس للقرب المضيء المضخم - مقايسة القرب القائم على الخرز. إنه يستخدم حبات متقبل ومتبرع متجانسة الحجم ، مثبتة ببروتينين يميلان إلى التفاعل لفحص الجزيئات الصغيرة المحتملة التي تمنع تفاعلات البروتين.

مقايسة متجانسة للقرب المضيء المضخم: اختبار القرب القائم على الخرزة لفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع تفاعلات البروتين والبروتين

ووصف نهج فحص المواد الموجهة لتطوير سول جل المستمدة من البروتين ميكروأرس مخدر باستخدام طريقة الناشئة دبوس الطباعة من تلفيق. ويتجلى هذا من خلال منهجية تطوير أستيل وmultikinase ميكروأرس، والتي تستخدم لفحص جزيء صغير فعالة من حيث التكلفة.

A مواد إرشادية النهج فحص لتطوير الكمي سول جل ميكروأرس بروتين المشتقة

باستخدام ميكروأرس البروتين تحتوي على ما يقرب من S. كامل تم بحثها الخباز بروتيوم للاستجواب غير متحيز السريع الآلاف من تفاعلات البروتين البروتين بشكل متواز. هذه الطريقة يمكن استخدامها ل-بروتين صغير جزيء أو تعديل posttranslational، وفحوصات أخرى في الإنتاجية العالية.

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

فحص مصفوفة الببتيد هو اختبار عالي الإنتاجية لتحديد مواقع تفاعل البروتين والبروتين. يسمح ذلك برسم خرائط للتفاعلات المتعددة للبروتين المستهدف ويمكن أن يكون بمثابة طريقة لتحديد مواقع المثبطات التي تستهدف البروتين. نصف هنا بروتوكولا لفحص وتحليل مصفوفات الببتيد.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

فسفرة البروتين هي سمة مركزية لكيفية تفسير الخلايا للمعلومات والاستجابة لها في بيئتها خارج الخلية. هنا ، نقدم بروتوكول فحص عالي الإنتاجية باستخدام الكينازات المنقاة من خلايا الثدييات لتحديد الكينازات التي تعمل على الفسفرة في ركيزة (ركيزة) ذات أهمية.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية

يمكن تصغير الطعوم الغريبة المشتقة من المريض من الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال إلى أورام دقيقة حية باستخدام نظام ثقافة بيوجيل بشري ثلاثي الأبعاد. هذا الاختبار ثلاثي الأبعاد الشبيه بالجسم الحي مناسب لاختبار الاستجابة للأدوية والتنميط الجزيئي ، بما في ذلك التحليل الحركي.

جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار

نقدم هنا، بروتوكولا لجسم صفائف لتحديد التغييرات في مسارات الإشارات في مختلف النماذج الخلوية. هذه التغييرات، ناجمة عن المخدرات/نقص/فائقة-فيوليت الضوء/الإشعاع، أو عن أوفيريكسبريشن/دوونريجوليشن/بالضربة القاضية، مهمان لنماذج مختلفة من المرض، ويمكن أن تشير إلى ما إذا كان علاج تكون فعالة، أو يمكن تحديد آليات للمخدرات المقاومة.

تقييم للمقاومة إلى تيروزين كيناز مثبطات تجواب مسارات توصيل الإشارات بجسم صفائف

نقدم هنا، بروتوكولا للشاشة البروتين خارج الخلية [ميكروارس] للتعرف على التفاعلات رواية مستقبلات-يجند في إنتاجية عالية. كما يصف لنا طريقة لتحسين الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين عابر باستخدام مجمعات البروتين-ميكروبيد.

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

والهدف من هذا البروتوكول هو التسمية، وإثراء، وتحديد ركائز للبروتين كيناز CK2 من عينة بيولوجية معقدة مثل خلية ليستي أو هوموجيناتي الأنسجة. هذا الأسلوب روافع الجوانب الفريدة للبيولوجيا CK2 لهذا الغرض.

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- 32 P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

اكتشف بروتوكول فحص مثبطات الكيناز باستخدام مصفوفات NAPPA البروتينية عالية الإنتاجية. تتيح هذه الطريقة التعبير عن الكينازات البشرية النشطة لمقارنة تأثيرات المثبطات عبر أنواع متعددة من الكينازات ومتغيراتها السريرية.

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

استكشف المزيد من الفيديوهات