استخدام اختبارات دخول الفيروسية وتحليل الإرساء الجزيئي لتحديد المرشحين المضادة للفيروسات ضد فيروس كوكساكي A16

ويمكن لهذا البروتوكول أن يساعد في اكتشاف الجزيئات الصغيرة المحتملة المضادة للفيروسات من خلال نهج يحركه الآلية. يحدد الوقت من إضافة فحص في أيّ خطوة من الإصابة الجزيء صغيرة يعرض نشاطه مضاد للفيروسات. يتنبأ الالتحام الجزيئي بالتفاعل بين الجزيء الصغير والبروتينات الفيروسية.

لتقييم تأثير المخدرات على الخلايا المضيفة قبل العدوى الفيروسية، والخلايا RD البذور في لوحات 12-جيدا في مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة في كثافة الطلاء جيدا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، علاج كل بئر من أحادية RD مع مركب اختبار الفائدة، في ثلاثليكات، في تركيزات غير سامة في ملليلتر واحد من المتوسطة القاعدية لمدة ساعة أو أربع ساعات.

في نهاية الحضانة العلاج، وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني قبل إضافة 50 وحدة تشكيل البلاك من الفيروس في 300 ميكرولترات من المتوسط القاعدي في البئر لمدة ساعة واحدة، مع هزاز كل 15 دقيقة. في نهاية حضانة العدوى، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتراكب الخلايا مع ملليلتر واحد من المتوسطة القاعدية الطازجة التي تحتوي على 0.8٪ ميثيلسيللوز. بعد 72 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية، وغسل كل جيدا مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع 0.5 ملليلتر من 37٪ الفورمالديهايد في بئر لمدة 15 دقيقة.

في نهاية التثبيت، وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني وصمة عار الخلايا مع 0.5 ملليلتر من 0.5٪ حل البنفسج الكريستال في بئر. بعد دقيقتين، اغسل الآبار بتيار لطيف من الماء واسمح لطبقة الهواء الجافة. ثم ضع لوحة على مربع الضوء الأبيض لحساب وحساب نسبة من الخلايا المصابة فيروس كوكساكي وفقا للصيغة.

لتحليل الإرساء الجزيئي، قم بتنزيل جزيئات ثلاثية الأبعاد من مركبات الاختبار من PubChem. إذا لم يكن للجزيء بنية ثلاثية الأبعاد تم تحميلها، قم بتنزيل الهيكل 2D أو استخدم تسلسل سلسلة SMILE لتحويل الهيكل إلى جزيء ثلاثي الأبعاد عبر برنامج جزيئي مناسب. المقبل, تحميل وحدة التجميع البيولوجية الفيروسية من بنك بيانات البروتين RCSB.

باستخدام برنامج مناسب للحوسبة الحيوية ، حذف المذيبات من ملف بنك بيانات البروتين ، واستبدال السلاسل الجانبية غير مكتملة باستخدام البيانات من مكتبة Rotamer Dunbrack 2010 وإضافة الهيدروجين والرسوم إلى الهيكل كما ذكر سابقا. لإرساء مركبات الاختبار على وحدة الفيروسات المعدة، تحميل ملف مجمع الاختبار في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو كيميرا كما ligand واختيار البروتين الفيروسي كله أعدت كما مستقبلات لأداء الالتحام الأعمى. للالتحام إضافية، حصر موقع الإرساء على البروتين الفيروسي للمناطق ذات الاهتمام المستمدة من نتائج الإرساء الأعمى عن طريق مزيد من الحد من حجم البحث.

ثم تحميل ملف الإرساء في نظام الرسومات الجزيئية المناسبة لتحليل مواقف وضع الربط. حدد ليغاند للعثور على جهات اتصال القطبية من المجمع إلى البروتين الفيروسي، وتحديد الاتصالات القطبية مع أي خيار الذرات. كلا من الجزيئات الصغيرة التي تم اختبارها في هذه التجربة التمثيلية ، أنتجت فقط تأثير هامشي ضد الفيروس الكاروكسي A16 العدوى ، سواء في المعالجة المسبقة للخلايا المضيفة قبل العدوى الفيروسية أو في علاج ما بعد العدوى.

في المقابل، الجزيئات بكفاءة إلغاء العدوى بنسبة أكبر من 80٪ في العلاج إضافة مشتركة، مما يشير إلى أن المركبين هي الأكثر فعالية عندما تكون موجودة في وقت واحد مع جزيئات الفيروس على سطح الخلية المضيفة أثناء الإصابة. تحليل الربط القائم على استئصال التدفق يؤكد أن العفصين منعا دخول الفيروس التكوكي A16 بالعدوى عن طريق منع ربط الجسيمات الفيروسية للخلايا المضيفة. الالتحام الجزيئي من العفص يشير إلى أن كلاهما من المتوقع أن ربط في منطقة الوادي من pentamer فيروس كوكساكي، فقط فوق مدخل الجيب الذي يحمل عامل الجيب ويلعب دورا هاما للتوسط كوكساكي الربط الفيروس والدخول في الخلية المضيفة.

في هذه الإسقاطات السطحية ، يمكن ملاحظة المخلفات الفريدة المتوقعة من الاتصالات القطبية للجزيئات الصغيرة حول مدخل الجيب ، مع الهليون -85 ، الlysine-257 ، والهليون -417 المشترك بين العفصين. بالنسبة للإرساء الجزيئي ، يجب أن تؤخذ طوبولوجيا البروتين الفيروسي في الاعتبار عند ترتيب الإطارات الملزمة. ويمكن أن تشمل التجارب الإضافية اختبار النشاط المضاد للفيروسات للمركب على الفيروسات المؤتلفة، مع اكتشاف طفرات على الأحماض الأمينية للتحقق من أهميتها لفعالية الدواء.