تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

يوضح هذا البروتوكول الكشف المتزامن لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والخلايا الحية والخلايا الميتة في الثقافات الأولية الحية من خلايا سطح العين الماوس. 2', 7'-Dichloroforesindiacetate, يتم استخدام يوديد البروبيديوم, وتلطيخ Hoechst لتقييم ROS, الخلايا الميتة, والخلايا الحية, على التوالي, تليها التصوير والتحليل.

مرحباً بالجميع، اسمي د.بيباشا بوس. أعمل أستاذاً مشاركاً و مسؤولاً في مركز الخلايا الجذعية والطب التجديدي، مركز ينبويا للأبحاث، جامعة ينبويا، مانجالور، الهند. الآن نحن نذهب لشرح كيفية الكشف عن وجود لروس وهذا هو ، أنواع الأكسجين التفاعلي "في الثقافات الحية من الأسطح العينية الماوس التي تعرضت لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية- جيم.

وميزة هذه التقنية هي أنه هنا يمكننا الكشف في وقت واحد عن وجود أنواع الأكسجين التفاعلية ، والخلايا الحية والميتة ، دون الحاجة إلى خلايا فيستر. مبدأ هذه التقنية يكمن أساسا في نفاذية الخلية الحية للصبغ DCFDA. DCFDA هو صبغة حية خلية عديم اللون، والتي خلال الأكسدة يحصل على التصرف من قبل أوكسيداسيس داخل الخلايا ويحصل على تحويلها إلى DCF الفلورية الخضراء.

وبالتالي، فإن الفلوريس الأخضر تمكننا من الكشف عن وجود أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الحية. من ناحية أخرى، يوديد بروبيديوم هو صبغة نفاذية الخلايا الميتة حصرا التي الفلوريس الأحمر. بل هو صبغة مزدوجة rDNA المتشابكة.

ومع ذلك ، فإن الصبغة هويشست هو permeant على حد سواء حية والخلايا الميتة. بل هو وصمة عار زرقاء اللون النووي. ومن ثم، فإن هذه طريقة بسيطة جداً يمكننا من خلالها اكتشاف وجود أنواع أكسجين تفاعلية في الثقافات طويلة الأجل بطريقة تعتمد على الزمن إلى جانب تقييم الخلايا الميتة.

لوحة نقطة مليوني خلية لكل 35 ملليمتر الأطباق الثقافية. الخلايا التي نطبقها هي الخلايا من سطح العين الماوس. إزالة الحد الأقصى لحجم وسائل الإعلام من كل من الأطباق ثقافة الخلية.

ترك وراءها حوالي 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام ثقافة الخلية على اتصال وثيق مع الخلايا. الحد الأدنى من وسائل الاعلام منع جفاف الخلايا. ومع ذلك ، فإن الغرض من الحد الأدنى من وسائل الإعلام هو السماح للاختراق الأقصى للتعرض UVC.

تأخذ الخلايا تحت مصدر الأشعة فوق البنفسجية، يمكن أن يكون إما Crosslinker الأشعة فوق البنفسجية، أو يمكن أن يكون أي مصدر الأشعة فوق البنفسجية-C الأخرى. تعريض الخلايا لجرعة مختلفة من إشعاع UVC مثل واحد، 10، 100، 1، 000، و 10، 000 جول لكل متر مربع. عندما تتعرض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية- C، ينبغي أن تكون الأغطية في وضع مفتوح.

وهذا سيسمح أقصى اختراق للأشعة فوق البنفسجية -C إلى الخلايا وبالتالي تظهر الجرعة المثلى استجابة للخلايا للأشعة فوق البنفسجية-C. جلب الخلايا إلى غطاء محرك الهواء غطاء الرأس الهواء laminar وتجديد كل من الأطباق مع ملليلتر اثنين من وسائل الإعلام كاملة. هذا الوسائط كاملة يحتوي على 20٪ مصل الأبقار الجنين في DMEM, تستكمل مع المكملات الغذائية مثل 1٪ الحد الأدنى من الأحماض الأمينية غير الأساسية, وأيضا 1٪ المضادات الحيوية التي هي البنسلين وstreptomycin.

بعد ذلك، بعد تجديد مع الحد الأقصى من حجم، وهذا هو ملليلتر اثنين من وسائل الإعلام كاملة، والعودة لوحات إلى الحاضنة واحتضان لمدة ثلاث ساعات من أجل رؤية الآثار المبكرة للأشعة فوق البنفسجية-C. إعداد خلية حية تلطيخ وسائل الإعلام في آخر 15 دقيقة من ثلاث ساعات الحضانة خلية UVC. يتم إعداد وسائل الاعلام تلطيخ في 10٪ FBS التي تحتوي على DMEM قبل warmed إلى 37 درجة.

لصنع 10 ملليلتر من وسائل الاعلام تلطيخ، أولا إضافة خمسة ميكرولتر من DCFDA من مخزون من 10 ملليمولار وذلك للحصول على تركيز النهائي من خمسة ميكرومولار. مزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. ثانيا، إضافة خمسة ميكرولتر من الحل Hoechst من مخزون من 10 ملليغرام لكل مل للحصول على تركيز النهائي من خمسة ميكروغرام لكل مل.

الآن مزيج جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. وأخيراً أضف 200 ميكرولترات من يوديد بروبديسيوم من مخزون من مليغرام واحد لكل مل للحصول على تركيز نهائي من 20 ميكروغرام لكل مل. مزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.

الآن حل تلطيخ جاهزة للاستخدام. بعد ثلاث ساعات من التعرض بعد الحضانة، إزالة لوحات من حاضنة CO2. التعرق من وسائل الإعلام من كل من الأطباق التي تعرضت لجرعة مختلفة من UVC مثل واحد، 10، 100، 1، 000، و 10، 000 جول لكل متر مربع.

الآن إضافة ملليلتر من الخلايا الطازجة على الهواء مباشرة تلطيخ وسائل الإعلام إلى كل من الأطباق بلطف من جانبي الأطباق. ارجع اللوحات إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون مرة أخرى وحضن لمدة 15 دقيقة لتلطين المباشر للخلايا. بعد 15 دقيقة من الحضانة في وسائل الاعلام تلطيخ الخلية الحية، وإزالة وسائل الاعلام تلطيخ من كل من الأطباق التي تحتوي على الخلايا المعرضة لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية-C.

قم بتجديد الخلايا بمليلترين من الوسائط الكاملة. الآن الخلايا جاهزة للعرض. الآن ضع خلايا التحكم تحت المجال المشرق من جهاز التصوير الفلورسنت.

الخلايا تبدو طبيعية على ما يبدو لأنها خلايا التحكم. تحت الحقل الأزرق يمكننا الخلايا الكلية المفلورة. تحت الحقل الأخضر يظهر جيل ROS.

منذ هذه هي خلايا التحكم، لا يوجد ROS ولدت. تحت الحقل الأحمر، وروبودييوم يوديد الخلايا الميتة الملون مرئية. ثم الحفاظ على الأشعة فوق البنفسجية يتعرض 100 جول لكل متر مربع تحت حقل مشرق.

تحت الحقل الأزرق، وأيضا يمكننا أن نرى العدد الإجمالي للخلية تحت الحقل الأزرق. ومع ذلك، عندما نتعرض للحقل الأخضر، وينظر DCFDA الخلايا الإيجابية، وأيضا PI خلايا ميتة إيجابية وينظر. وأخيرا، ضع جرعة الأشعة فوق البنفسجية القصوى، وهذا هو 10،000 جول لكل متر الخلايا المكشوفة مربع، تحت حقل مشرق.

يمكننا أن نرى مورفولوجيا الخلية غير الطبيعية. ومع ذلك ، تحت الحقل الأزرق يمكننا أن نرى الخلايا الزرقاء الكلية. تحت الحقل الأخضر، وينظر الأخضر الفلورية DCFDA الخلايا الإيجابية تشير إلى جيل ROS.

عندما تتعرض الخلايا للحقل الأحمر، كانت جميع الخلايا الفلوريسكينغ الأحمر مما يدل على عدد كبير من موت الخلايا عندما يتم التعامل مع الخلايا مع 10،000 جول لكل متر مربع من جرعة الأشعة فوق البنفسجية. الآن ترتيب الصور التي تم التقاطها في قنوات مختلفة في لوحة صورة مركبة واحدة المقابلة لجرعات الأشعة فوق البنفسجية C والضوابط غير مكشوف. يتم ترتيب الصور في لوحة واحدة في المجموعة.

أولاً، الحقل المشرق. ثانياً، البقعة النووية الزرقاء (هويشست) ثالثا ، مادة يوديد البروديوم تلطيخ كما للنيات الميتة.

رابعاً، DCFDA للخلايا الإيجابية ROS. وخامساً، الصورة المدمجة. عندما ننظر إلى الصف الأول والثاني من الصور، وهذا هو التحكم غير المكشوف والخلايا المعرضة لجرعة UVC جول واحد لكل متر مربع، لاحظنا أنه لم يكن هناك PI ولا ROS الخلايا الإيجابية التي كانت مضاءة، مما يشير إلى غياب كامل للروس وموت الخلايا في ضوابط غير مكشوفة ومثل هذه جرعة منخفضة UVC من جول واحد لكل متر مربع.

الآن القادمة إلى الصف الثالث من الصور المركبة من الخلايا التي تعرضت ل100 جول لكل متر مربع. نسبة منخفضة جدا من الخلايا، حوالي 10٪ كانت إيجابية لكل من PI وDCFDA في هذه الجرعة، مما يدل على انخفاض كمية من جيل ROS وموت الخلايا. الآن ننتقل إلى مزيد من جرعة أعلى من التعرض للإشعاع UVC، وهذا هو 1،000 جول لكل متر مربع كما هو مبين في الصف الرابع من الصورة المركبة.

هنا، كان حوالي 70٪ من الخلايا إيجابية لPI وDCFDA. وأخيرا ، ننتقل إلى أعلى جرعة من التعرض للأشعة فوق الزعنفة ، وهذا هو 10000 جول لكل متر مربع كما هو الحال في الصف الخامس من الصورة المركبة. هنا وجدت أن ما يقرب من 100٪ من الخلايا كانت إيجابية لكل من PI وDCFDA، مما يدل على موت 100٪ خلية وروز جيل في هذه الجرعة UVC خاصة.

نقل الصور إلى برنامج التصوير. فتح أول صورة زرقاء تشير إلى النوى الملطخة Hoescht، وهذا هو العدد الإجمالي للخلايا. افتح أداة العد وانقر فوق كل خلية واحدة في كل مرة للحصول على الرقم.

الآن فتح الصورة التي تم التقاطها تحت القناة الحمراء تشير إلى PI الخلايا الميتة إيجابية. افتح أداة العد وانقر فوق كل نقطة حمراء تشير إلى عدد الخلايا الميتة الإيجابية PI. مرة واحدة في عد الخلايا الميتة هو أكثر، انقر على القناة الخضراء القبض على الخلايا وفتح أداة العد وانقر فوق كل من البقع الخضراء التي تشير إلى الخلايا التي تظهر جيل ROS.

استكمال عد الخلايا الخضراء التي تم التقاطها تحت القناة الخضراء، ثم استخدام الصيغة تعداد النسبة المئوية لوفيات الخلايا عن طريق تلف UVC والنسبة المئوية لإنتاج ROS بواسطة تلف UVC. يتم حساب هذا باستخدام عدد الصيغة البسيطة للخلايا الإيجابية PI، وهذا هو الخلايا المفلورة الحمراء، مقسوما على عدد من الخلايا الإيجابية Hoechst مضروبة في 100. النسبة المئوية لإنتاج ROS بواسطة أضرار الأشعة فوق البنفسجية يتم حسابها باستخدام الصيغة، عدد DCFDA إيجابية، أو الخلايا الفلورية الخضراء، مقسوما على عدد من الخلايا الإيجابية Hoechst مضروبة في 100.

وبمجرد حصولك على كل من النسب المئوية، وهي النسبة المئوية لوفيات الخلايا والنسبة المئوية لإنتاج ROS، استخدم هذه القيم لرسم رسم بياني شريطي. يشير المحور س إلى جرعة الأشعة فوق البنفسجية، في حين يشير المحور ص إلى النسبة المئوية للخلايا. تشير الأشرطة الخضراء إلى النسبة المئوية لـ ROS، في حين يشير الشريط الأحمر إلى النسبة المئوية لوفيات الخلايا.

على التحليل, ومن الواضح أن في جرعة UVC 100 جول هناك 10٪ ROS توليد الخلية، فضلا عن موت خلية 10٪.10٪. في حين أن في جرعة UVC 10 التي أثيرت إلى ثلاثة جول لكل متر مربع, 70٪ أظهرت الخلايا روز جيل وكذلك موت الخلايا. بينما في أعلى جرعة من UVC، وهذا هو 10 التي أثيرت إلى أربعة جول لكل متر مربع، حوالي 100٪ أظهرت الخلايا موت الخلايا وكذلك إنتاج ROS.

وبالتالي، يمكن استنتاج أن هناك علاقة إيجابية قوية بين جيل ROS وموت الخلايا. في الختام ، هذه التقنية هي مفيدة جدا لتقييم المتزامنة لأنواع الأكسجين التفاعلية ، والخلايا الحية والميتة في العيش ، وثقافة الحدث العادي. هذه التقنية مفيدة أيضا لتقييم محدود لأنواع الأكسجين التفاعلية، والخلايا الحية والميتة، في الثقافات على المدى الطويل التي تعرضت لمختلف العوامل الضارة الخلايا مثل الأشعة فوق البنفسجية، أو العوامل الكيميائية.

ويمكن لهذه التقنية أيضا توجيه الباحث لتحديد الوقت الأمثل لحصاد الخلايا مثل في 50٪ ROS، 75٪ ROS، وذلك وهكذا دواليك كما يمكن أن يكون هناك للعديد من التطبيقات المصب، مثل QR إلى PCR ونشاف الغربية.