تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة
August 16th, 2019
في هذا الإجراء، يتم تعطيل الرباط الظهاري القائم على DsRed لإنتاج راتنج تقارب انتقائي للغاية لالتقاط الأجسام المضادة أحادية النسيلة من مستخلصات النباتات الخام أو اللاتابات ثقافة الخلية، كبديل للبروتين A.
تسيطر الأجسام المضادة أحادية النسيلة على سوق الأدوية الحيوية ويتم تنقيتها عادة من قبل البروتينات اللونية. الراتنج وفقا هو سائق تكلفة رئيسية أثناء الإنتاج التي تؤثر على سعر العلاجات المضادة القائمة. هنا نحن وصف رابطة تقارب جديدة على أساس البروتين الفلورسنت التي تقرأ على أنها الناقل لeptope خطي من فيروس نقص المناعة البشرية تحييد الأجسام المضادة 2F5.
بشكل عام يسمح أسلوبنا جيل سريع من راتنجات اللونية تقارب التي يمكن استخدامها لالتقاط الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وقد أثبتنا هذه القدرة من خلال التقاط الأجسام المضادة 2F5 من استخراج مصنع الخام. نحن الأمثل ظروف التقاط ومخزن الحل من أجل تحسين القدرة على ربط دينامية وإعادة الاستخدام الراتنج.
يسمح راتنجنا عموماً بظروف أكثر مرونة من البروتين A ولديه القدرة على تقليل تكاليف تنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن تكيف الراتنج للأجسام المضادة الأخرى التي ترتبط epitopes الخطية. لبدء هذا الإجراء، ضبط تركيز حل رابطة التقارب المعدة بحيث يكون في نطاق 5 إلى 15 غراما للتر الواحد كما هو محدد من قبل تصميم التجارب.
تخزين الحل على الجليد حتى رد فعل اقتران جاهز. بعد ذلك، قم بتعبئة حقنة واحدة ذات ملليلتر بمحلول DFE. وإعداد محول لتركيب الحقن على أعمدة agarose عبر الارتباطات عبر NHS بحجم سرير واحد ملليلتر.
لكل 10 أعمدة تستخدم في اقتران، إعداد 30 ملليلتر من حل التعطيل، 30 ملليلتر من محلول منخفض pH، و ملليلتر واحد من حل التخزين. ثم أعد 20 ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك المليمولر الواحد في أنبوب. و احتضنه على الثلج لمدة 20 دقيقة على الأقل
إعداد مقياس دقيق لمراقبة تدفق من خلال الكسور لجميع الخطوات خلال التفاعل اقتران. بعد هذا، فتح عمود أغاروز مختومة تنشيط NHS عبر الاتّصال. تطبيق قطرة من المخزن المؤقت على مدخل المحول، لمنع الهواء من دخول العمود.
قم بتركيب محول الحقنة في مدخل العمود. غسل العمود مع ستة ملليلتر من الجليد بارد حمض الهيدروكلوريك ملليمولار واحد، بمعدل تدفق أقل من ملليلتر واحد في الدقيقة. باستخدام حقنة مليلترتين، قم على الفور بحقن 1.5 ملليلتر من محلول DFE بمعدل تدفق أقل من ملليلتر واحد في الدقيقة.
وجمع تدفق من خلال كسر على مقياس دقيق لتحليل لاحق. ختم العمود في كلا الطرفين واحتضان لمدة 15 إلى 45 دقيقة، في 22 درجة مئوية. حقن المقبل ستة ملليلتر من حل التنشيط، تليها ستة ملليلتر من محلول pH منخفضة، بمعدل تدفق أقل من ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة، وإزالة غير التكافؤ ملزمة يغاندس من الراتنج.
قم بإدخال ستة ملليلترات من حل التنشيط، واحتضان العمود لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، حقن ستة ملليلتر من محلول pH منخفض في العمود. متبوعة بستة ملليلترات من حل التنشيط.
ثم حقن آخر ستة ملليلتر من محلول منخفض pH في العمود. حقن مليلترين من محلول التخزين في العمود، وتخزينه عند أربع درجات مئوية. أولاً إعداد 100 ملليلتر من استخراج النبات أوضح تحتوي على 2F5، أو عظمى لنظام التعبير المفضل على أساس الخلية، والذي يحتوي أيضا 2F5.
المقبل إعداد العازلة التوازن، والحديد العالي X قوة الوهم العازلة، كما هو مبين في بروتوكول النص. قم بمسح نظام الكروماتوغرافيا بالمخازن المؤقتة. قم بتحميل عمود تقارب DFE على نظام الكروماتوغرافيا.
وتككيل مع خمسة السيرة الذاتية من العازلة التوازن، بمعدل تدفق ملليلتر واحد في الدقيقة. مراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر. ثم تحميل 80 ملليلتر من استخراج النبات أوضح، أو عظمى على العمود بمعدل تدفق 5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة.
لضمان وقت الاتصال دقيقتين. جمع تدفق من خلال عينات في 2 ملليلتر الكسور أو إعادة بناء منحنى اختراق. تخزين تدفق من خلال العينات في أربع درجات مئوية، إذا كان تحليل العينة الفورية غير ممكن.
بعد هذا غسل العمود مع 6CV من العازلة التوازن. جمع عينة في بداية، منتصف ونهاية الغسيل. تمييع MAB2F5 مع خمسة مجلدات من قوة عالية من قوة الوهم العازلة.
جمع كسر DFE عندما زادت إشارة الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر إلى خمسة وحدات امتصاص ملي فوق خط الأساس. تحسين العازلة الوهم لكل زوج epitope-الأجسام المضادة، كما هو موضح في بروتوكول النص. يتم التعبير عن البروتين الانصهار DFE في نباتات التبغ المعدلة وراثيا، التي تزرع في الدفيئة.
الانتعاش العام للDFE هو 23.5 ملليغرام لكل كيلوغرام. مع نقاء أكثر من 90٪ المبلغ المطلق من DFE شل على الراتنج يزيد مع كتلة DFE حقن في العمود، والهضاب في حوالي 15 غراما للتر الواحد، في حين أن العائد اقتران ينخفض باستمرار كما يتم حقن أكثر DFE. وينظر إلى جزيئات DFE للاحتفاظ فلوركينس الأحمر، حتى بعد اقتران.
كثافة اللون يتوافق مع المبلغ الإجمالي للDFE شل. لذلك يمكن استخدام لون العمود كمعلمة بسيطة لمراقبة الجودة لتقدير كفاءة اقتران، ونوعية العمود. يتم إنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة 2F5 بشكل عابر في نباتات نيكوتيانا بنثاميانا التي تزرع في النبات.
يتم اختبار التقاط 2F5 من استخراج مصنع الخام، باستخدام أعمدة تقارب، إلى جانب ما يقرب من سبعة ملليغرام من DFE المنقاة. تركيز كلوريد المغنيسيوم من 1.25 الضرس كافية ل2F5 elute من الراتنج تقارب DFE مع الانتعاش ما يقرب من 100٪ ونقاء ما يقرب من 97٪ وهو مماثل للراتنجات البروتين A. DBC من الراتنج تقارب DFE في 10٪ 2F5 اختراق، ينخفض خطيا على مدى الدورات 25، إلى حوالي 15٪ من القيمة الأولية.
استخدمنا تصميم نهج التجارب لتحسين القدرة على الاقتران لدينا رابطة تقارب. هذه الشروط يمكن ضبطها بدقة ليغاند أخرى في المستقبل. يستخدم أسلوبنا البروتين الفلورسنت لخيط بروتين الناقل الفرعية للمنتج يغاند محددة.
في الوقت نفسه فقط إضافة وظائف كمؤشر جودة بصرية من إجراءات التعبئة، وتوفير تغذية مرتدة فورية وبديهية للمشغل.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة راتنجًا جديدًا يعتمد على DsRed لالتقاط انتقائي للأجسام المضادة أحادية النسيلة من المستخلصات النباتية الخام أو مخلفات الثقافة الخلوية. تهدف الطريقة إلى تقليل تكاليف التنقية مقارنة بكروماتوغرافيا البروتين A التقليدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التكنولوجيا الحيوية
- تنقية البروتين
- الأجسام المضادة أحادية النسيلة
الخلفية
- الأجسام المضادة أحادية النسيلة ضرورية في المستحضرات الصيدلانية الحيوية.
- كروماتوغرافيا البروتين A هي طريقة تنقية شائعة ولكنها مكلفة.
- هناك حاجة إلى طرق جديدة لخفض تكاليف الإنتاج.
- يمكن استخدام البروتينات الفلورية في الكروماتوغرافيا بالانتحاب.
غرض الدراسة
- تطوير راتنج انتحاب بديل لتنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة.
- تحسين ظروف التقاط لزيادة قدرة الارتباط.
- إثبات تكيف الراتنג لمختلف الأجسام المضادة.
الطرق المستخدمة
- تحضير محلول رابط انتحاب يعتمد على DsRed.
- ربط الرابط بأعمدة أغاروز نشطة بـ NHS.
- اختبار الراتننج بمستخلَصات نباتية مصفى تحتوي على أجسام مضادة.
- مراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية خلال خطوات التنقية.
النتائج الرئيسية
- يسمح الراتننج الجديد بالتقاط الأجسام المضادة بكفاءة ونقاء عاليين.
- تم تحقيق معدلات استعادة تصل إلى 100% تقريبًا للأجسام المضادة التي تم اختبارها.
- أظهر الراتننج قابلية لإعادة الاستخدام أفضل من البروتين A.
- يمكن مراقبة كفاءة الربط بصريًا من خلال الفلوريسنس.
الاستنتاجات
- الراتننج المعتمد على DsRed هو بديل واعد لتنقية الأجسام المضادة.
- يمكنه خفض التكاليف المحتملة في إنتاج المستحضرات الصيدلانية الحيوية.
- التكيفات المستقبلية لأجسام مضادة أخرى ممكنة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Protein A chromatography remains a major cost driver in monoclonal antibody purification, impacting the affordability of biologics. This method presents a cost-effective alternative using a DsRed-based affinity ligand immobilized on activated cross-linked agarose, enabling selective capture of antibodies with linear epitopes from crude extracts. The approach supports early-stage target validation and assay development by providing a reusable, visually quantifiable resin system that reduces reliance on expensive ligands.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through selective capture of epitope-specific antibodies from complex mixtures.
- Operational Value: Supports biological de-risking by validating target engagement using a linear epitope ligand expressed in plant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized affinity matrix for quantitative measurement of antibody binding in crude extracts.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through fluorescence-based coupling efficiency monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by allowing purification of functional antibodies from disease-relevant expression systems.
- Operational Value: Supports predictive confidence in lead identification through consistent recovery and purity across multiple cycles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, offering a platform for rapid resin generation applicable to multiple antibody targets with linear epitopes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of specific antibodies from complex biological samples.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via UV absorbance monitoring and fluorescence-coupled ligand quantification.
- Analytics: Provides measurable readouts such as dynamic binding capacity and recovery rates to compare purification conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by producing purified antibodies suitable for functional validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for rapid adaptation to new antibody targets through ligand exchange.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in antibody-ligand interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of resin production using design-of-experiments optimization.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early purification feasibility.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on achievable purity and recovery metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, purification, and conjugation chemistry.
- Needs instrumentation for flow-controlled coupling, UV monitoring, and fraction collection.
- Demands cross-team standardization of ligand concentration, buffer conditions, and coupling timelines.
- Involves adaptation considerations for different epitope-antibody pairs, particularly in optimizing elution buffers.
- Includes practical limitations such as ligand leaching over cycles and declining dynamic binding capacity with reuse.
